新手想做好ELISA實(shí)驗(yàn)得注意哪些問(wèn)題？
Elisa方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測(cè)定.在Elisa測(cè)定中影響因素較多,在檢測(cè)過(guò)程中除正常反應(yīng)外,有時(shí)常見(jiàn)到一些錯(cuò)誤的結(jié)果.引起ELISA測(cè)定錯(cuò)誤結(jié)果的原因主要有：標(biāo)本因素；試劑因素；操作因素.
1．樣品稀釋
一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過(guò)大量試驗(yàn)確定,以保證試驗(yàn)的靈敏度和特異性.酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),如果血清不稀釋,不可避免會(huì)產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),出現(xiàn)假陽(yáng)性.
2．試劑盒平衡
Elisa中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗(yàn)前平衡至室溫(約25℃),一般需在室溫放置20～30分鐘以上.平衡時(shí)間太短會(huì)造成試劑混勻不夠,樣品孵育時(shí)間相對(duì)縮短,ELISA反應(yīng)不夠充分.冬季室溫低,可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘.
3．樣品和試劑的混勻
在稀釋前、后的樣品必須充分混勻,所有試劑在加樣前也須搖勻,以保證試驗(yàn)的均一性.
4．加樣
加樣是一項(xiàng)很重要的步驟.加樣不可太快,要避免加在孔壁上部,不可濺出和產(chǎn)生氣泡.加樣太快,無(wú)法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性.加在孔壁上部的非包被區(qū),易導(dǎo)致非特異吸附.
5．溫育
溫育是ELISA測(cè)定中影響測(cè)定成敗為關(guān)鍵的一個(gè)因素.ELISA作為一種固相免疫測(cè)定,抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行,要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原*結(jié)合,必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時(shí)間.
6．洗板
固相免疫測(cè)定技術(shù)是一種非均相免疫測(cè)定技術(shù),需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過(guò)程中吸附的非特異成份分離開(kāi)來(lái),以保證ELISA測(cè)定的特異性.洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘,甩去板孔中洗液后,一定要大力拍干；及時(shí)更換吸水紙,尤其是拍過(guò)酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去,否則可能影響試驗(yàn)結(jié)果.
7．顯色
顯色一定要控制時(shí)間,根據(jù)試劑盒說(shuō)明操作即可.一般來(lái)說(shuō),顯色時(shí)間過(guò)短,結(jié)果偏低；顯色時(shí)間過(guò)長(zhǎng),空白增高或者非特異性顯色增加.
8．比色
比色要注意波長(zhǎng)的選擇.以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用,而前者比色波長(zhǎng)為450nm,后者為492nm,濾光片需根據(jù)要求隨時(shí)更換.因此,容易出現(xiàn)濾光片錯(cuò)用的問(wèn)題.
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