ELISA 的技術(shù)要點(diǎn)包括三個方面：試劑的制備、反應(yīng)條件的選擇和操作的標(biāo)準(zhǔn)化。

一、試劑的制備

ELISA 的主要試劑為固相的抗原或抗體、酶標(biāo)記的抗原或抗體和與標(biāo)記酶直接關(guān)聯(lián)的酶反應(yīng)底物。以下敘述這些試劑的原料和制備方法。

（一）固相載體

可作 ELISA 中載體的物質(zhì)很多，常用的是聚苯乙烯。聚苯乙烯具有較強(qiáng)的吸附蛋白質(zhì)的性能，抗體或蛋白質(zhì)抗原吸附其上后保留原來的免疫活性。聚苯乙烯為塑料，可制成各種形式。在 ELISA 測定過程中，它作為載體和容器，不參與化學(xué)反應(yīng)。加之它的價格低廉，所以被普遍采用。

ELISA 載體的形狀主要有三種：小試管、小珠和微量反應(yīng)板。小試管的特點(diǎn)是還能兼作反應(yīng)的容器，后放入分光光度計中比色。小珠一般為直徑 0.6 cm 的圓球，表面經(jīng)磨砂處理后吸附面積大增加。如用特殊的洗滌器，在洗滌過程中使圓珠滾動淋洗，效果更好。常用的載體為微量反應(yīng)板，于 ELISA 測定的產(chǎn)品也稱為 ELISA 板，通用的標(biāo)準(zhǔn)板形是 8×12 的 96 孔式。為便于作少量標(biāo)本的檢測，有制成 8 聯(lián)或 12 聯(lián)孔條的，放入座架后，大小與標(biāo)準(zhǔn) ELISA 板相同。ELISA 板的特點(diǎn)是可以同時進(jìn)行大量標(biāo)本的檢測，并可在特定的比色計上迅速讀出結(jié)果。現(xiàn)在已有多種自動化儀器用于微量反應(yīng)板型的 ELISA 檢測，包括加樣、洗滌、保溫、比色等步驟，對操作的標(biāo)準(zhǔn)化極為有利。

良好的 ELISA 板應(yīng)該是吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之間和同一板各孔之間性能相近。聚苯乙烯 ELISA 板由于配料的不同和制作工藝的差別，各種產(chǎn)品的質(zhì)量差異很大。因此每一批號的聚苯乙烯制品在使用前須檢查其性能。常用的檢查方法為：以一定濃度的人 IgG（一般為 10ng/ml）包被 ELISA 板各孔后，每孔內(nèi)加入適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗人 IgG 抗人 IgG 抗體，保溫后洗滌，加底物顯色，終止酶反應(yīng)后分別測每孔溶液的吸光度。控制反應(yīng)條件，使各讀數(shù)在 0.8 左右。計算所有讀數(shù)的平均值。所有單個讀數(shù)與平均讀數(shù)之差應(yīng)小于 10％。

與聚苯乙烯類似的塑料為聚氯乙烯。作為 ELISA 固相載體，聚氯乙烯板的特點(diǎn)為質(zhì)軟板薄，可切割，價廉、但光潔度不如聚苯乙烯板。聚氯乙烯對蛋白質(zhì)的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值有時也略高。

為比較不同固相在某一 ELISA 測定中的優(yōu)劣，可用以下方法加以檢驗(yàn)：用其它免疫學(xué)測定方法選出一個典型的陽性標(biāo)本和一個典型的陰性標(biāo)本。將它們分別進(jìn)行一系列稀釋后，在不同的固相載體上按預(yù)定的 ELISA 操作步驟進(jìn)行測定，然后比較測定結(jié)果。在哪一種載體上陽性結(jié)果與陰性結(jié)果判別大，這種載體就是這一 ELISA 測定的合適的固相載體。

除塑料制品外，固相酶免疫測定的載體還有兩種材料：一是微孔濾膜，如硝酸纖維素膜、尼龍膜等，這類測定形式將在本章第五節(jié)「膜載體的酶免疫測定」中介紹。另一種載體是以含鐵的磁性微粒制作的，反應(yīng)時固相微粒懸浮在溶液中，具有液相反應(yīng)的速率，反應(yīng)結(jié)束后用磁鐵吸引作為分離的手段，洗滌也十分方便，但需配備特殊的儀器。

（二）抗原和抗體

在 ELISA 實(shí)施過程中，抗原和抗體的質(zhì)量是實(shí)驗(yàn)是否成功的關(guān)鍵因素。本法要求所用抗原純度高，抗體效價高、親和力強(qiáng)。

ELISA 所用抗原有三個來源：天然抗原、重組抗原和合成多肽抗原。天然抗原取材于動物組織或體液、微生物培養(yǎng)物等，一般含有多種抗原成分，需經(jīng)純化，提取出特定的抗原成分后才可應(yīng)用，因此也稱提純抗原（purifiedantigen）。重組抗原（recombinantantigen）和多肽抗原（peptideantigen）均為人工合成品，使用安全，而且純度高，干擾物質(zhì)少。因此雖然制備合成抗原有較高的技術(shù)難度且要求較為昂貴的儀器設(shè)備和試劑，其應(yīng)用仍十分普遍，特別是對那些天然抗原不易得到的試驗(yàn)，更顯出其獨(dú)到之處。

用于 ELISA 的抗體有多克隆的和單克隆的。抗血清成分復(fù)雜，應(yīng)從中提取 IgG 才可用于包被固相或酶標(biāo)記。含單克隆抗體的小鼠腹水中的特異性抗體含量較高，有時可適當(dāng)稀釋后直接進(jìn)行包被。制備酶結(jié)合物用的抗體的質(zhì)量往往要求有較高的純度。經(jīng)硫酸銨鹽析純化的 IgG 可進(jìn)一步用各種分子篩層析提純。也可用親和層析法提純特異性 IgG，如用酶消化 IgG 后提取的 Fab 片段，則效果更好。

（三）免疫吸附劑

固相的抗原或抗體稱為免疫吸附劑。將抗原或抗體固相化的過程稱為包被（coating）。由于載體的不同，包被的方法也不同。如以聚苯乙烯 ELISA 板為載體，通常將抗原或抗體溶于緩沖液（常用的為 pH9.6 的碳酸緩沖液）中，加于 ELISA 板孔中在 4℃ 過夜，經(jīng)清洗后即可應(yīng)用。如果包被液中的蛋白質(zhì)濃度過低，固相載體表面有能被此蛋白質(zhì)*覆蓋，其后加入的血清標(biāo)本和酶結(jié)合物中的蛋白質(zhì)也會部分地吸附于固相載體表面，后產(chǎn)生非特異性顯色而導(dǎo)致本底偏高。在這種情況下，如在包被后再用 1％～5％ 牛血清白蛋白包被一次，可以消除這種干擾。這一過程稱為封閉（blocking）。包被好的 ELISA 板在低溫可放置一段時間而不失去其免疫活性。

（四）酶和底物

ELISA 中所用的酶要求純度高、催化反應(yīng)的轉(zhuǎn)化率高、專一性強(qiáng)、性質(zhì)穩(wěn)定、來源豐富、價格不貴、制備成的酶標(biāo)抗體或抗原性質(zhì)穩(wěn)定，繼續(xù)保留著它的活性部分和催化能力。在受檢標(biāo)本中不存在與標(biāo)記酶相同的酶。另外它的相應(yīng)底物應(yīng)易于制備和保存，價格低廉，有色產(chǎn)物易于測定，光吸收高。ELISA 中常用的酶為辣根過氧化酶（HRP）和從牛腸粘膜或大腸桿菌提取的堿性磷酸酶（AP）。

HRP 在蔬菜作物辣根中含量很高，純化方法也不復(fù)雜。它是一種糖蛋白，含糖量約 18％；分子量為 44kD；是一種復(fù)合酶，由主酶（酶蛋白）和輔基（亞鐵血紅素）結(jié)合而成的一種卟啉蛋白質(zhì)。主酶為無色糖蛋白，在 275nm 波長處有吸收峰；輔基是深棕色的含鐵卟啉環(huán)，在 403nm 波長處有吸收峰。

（五）結(jié)合物

酶標(biāo)記的抗原或抗體稱為結(jié)合物（conjugate）。抗原由于化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，可用不同的方法與酶結(jié)合。如為蛋白質(zhì)抗原，基本上可參考抗體酶標(biāo)記的方法。制備抗體酶結(jié)合物的方法通常有以下幾種。

1．戊二醛交聯(lián)法戊二醛是一種雙功能團(tuán)試劑，可以使酶與蛋白質(zhì)或其他抗原的氨基通過它而偶聯(lián)。戊二醛交聯(lián)可用一步法（如連接 AP），也可用二步法（如連接 HRP）。舉例如下：

2～5 mg 純抗體與 5 mgAP 混合于 0.1mol/LpH6.8 的磷酸緩沖液 1 ml 中，4℃ 下對同上緩沖液透析平衡。磁力攪拌下，緩慢加入 1％ 戊二醛 0.05 ml，在室溫下放置 2 小時。在 4℃ 下對 0.05mol/LpH8.0Tris 緩沖液透析平衡，即得酶標(biāo)抗體。

辣根過氧化物酶可溶解于 50％ 飽和度硫酸銨中。用上法交聯(lián)后可用 50％ 飽和度硫酸銨沉淀酶標(biāo)抗體，棄去上清中游離酶。

戊二醛一步法操作簡便、有效，而且重復(fù)性好。缺點(diǎn)是交聯(lián)時分子間的比例不嚴(yán)格，大小也不一，影響效果。

制備 HRP 抗體結(jié)合物也可用二步法，即先將 HRP 與戊二醛作用，透析除去戊二醛，在 pH9.5 緩沖液中再與抗體作用而形成酶標(biāo)抗體。此法的效率可高于一步法 10 倍左右。

2．過碘酸鹽氧化法本法只用于 HRP 的交聯(lián)。該酶含 18％ 碳水化合物，過碘酸鹽將其分子表面的多糖氧化為醛基。用硼氫化鈉（NaBH4）中和多余的過碘酸。酶上的醛根很活潑，可與蛋白質(zhì)結(jié)合，形成按摩爾比例結(jié)合的酶標(biāo)結(jié)合物。有人認(rèn)為此法為辣根過氧化物酶交聯(lián)有效的方法。但也有只認(rèn)為由于所用試劑較為劇烈，各批實(shí)驗(yàn)結(jié)果不易重復(fù)。

按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游離酶不影響 ELISA 中后的酶活性測定，因經(jīng)過洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已被洗去。但游離的抗體則會與酶標(biāo)抗體競爭相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體量。因此制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。純化的方法較多，分離大分子混合物的方法均可應(yīng)用。硫酸銨鹽析法操作簡便，但效果不如用 SephadexG-200 凝膠過濾的好。