本文重點(diǎn)講述 IHC 操作流程中的關(guān)鍵步驟，并提供數(shù)據(jù)以支持及解釋 CST 在實(shí)驗(yàn)過程中所提的建議。后，本指南列出了 CST 科學(xué)家內(nèi)部常用且適用于與抗體配套使用的 IHC 試劑。

抗原修復(fù)—熱誘導(dǎo)的抗原表位修復(fù) (HIER)

緩沖液

適用于 HIER 的緩沖液有多種。而 CST 常推薦的兩種緩沖液是：pH6, 10 mM 檸檬酸鹽緩沖液和 pH 8, 1 mM EDTA 緩沖液。緩沖液是否適用于您的實(shí)驗(yàn)取決于您所使用的一抗。請(qǐng)查閱產(chǎn)品說明書中所推薦的用于特異性抗體的修復(fù)緩沖液。一般而言，EDTA 緩沖液適用于多數(shù)磷酸化酪氨酸特異性抗體，而檸檬酸鹽緩沖液適用于其他多數(shù)抗體。每天都需制備新鮮的 1X 溶液。

抗體：hospho-HER3/ErbB3 (Tyr1289) (D1B5) Rabbit mAb

樣本：蠟包埋人類肺部腫瘤

抗原修復(fù)緩沖液：檸檬酸鹽緩沖液或者 EDTA 緩沖液

煮沸裝置

載玻片在所推薦的緩沖液中加熱煮沸一段時(shí)間后，才可引起抗原修復(fù)。該步驟通常在微波爐或高壓鍋中進(jìn)行。雖然，一些研究人員也使用水浴鍋，但是，因?yàn)樵摬襟E中所選擇的裝置對(duì)染色存在積極或消極的影響。所以，我們建議使用微波爐或高壓鍋加熱煮沸以達(dá)到抗原修復(fù)效果。

抗體：Phospho–Stat3 (Tyr705)(D3A7) XP. Rabbit mAb

樣本：石蠟包埋人類肺部腫瘤樣本

煮沸設(shè)備：浴鍋 ，微波爐，高壓鍋

免疫染色—封閉

在 IHC–P 中，我們建議在室溫下在含有 Tween20 的 TBST 緩沖液和 5% 正常山羊血清 (NGS) 中封閉樣品，時(shí)長(zhǎng) 1 小時(shí)，以防止非特異性背景染色。在進(jìn)行 IHC–F 時(shí)，在含有 0.3% Triton. X–100 的 1X TBS 和 5% NGS 中封閉樣品。市售的含有酪蛋白的封閉溶液與磷酸化的一抗結(jié)合后易減弱信號(hào)；因此，我們建議不使用含有酪蛋白的封閉劑進(jìn)行磷酸化特異性抗體的檢測(cè)。以上針對(duì)封閉步驟所提建議均是在以 SignalStain. Boost IHC Detection Reagent 作為檢測(cè)試劑的情況下提出的。如果選擇使用其他檢測(cè)試劑，我們則建議使用與二抗來源相同的血清進(jìn)行封閉。

抗體：Phospho–Histone H2A.X (Ser139) (20E3) Rabbit mAb

樣本：石蠟包埋人類乳xian腫瘤

封閉：含 5% 山羊血清 (NGS) 的 TBST或者基于酪蛋白封閉劑

一抗孵育—抗體稀釋液

在 IHC–P 中，有多種抗體稀釋液可供選擇，但是所選擇的抗體稀釋劑對(duì)染色效果具有顯著影響。在 CST，我們利用 SignalStain. 抗體稀釋液、TBST/5% NGS（含 5% 山羊血清的 TBST）或者 PBST/5%NGS(含 5％ 山羊血清的 PBST) 來稀釋一抗。因?yàn)楹线m的稀釋劑具有抗體特異性；因此，查閱產(chǎn)品說明書中針對(duì)使用的抗體所推薦的稀釋劑。在進(jìn)行 IHC–F 過程中，一抗應(yīng)在封閉緩沖液 (TBS/0.3%Triton. X–100/5% NGS) 中稀釋。

抗體：Phospho–Akt (Ser473) (D9E) XP. Rabbit mAb、Phospho–EGF

Receptor (Tyr1173) (53A5) Rabbit mAb

樣本：石蠟包埋人類乳xian腫瘤和 HCC827 異種移植物

抗體稀釋：SignalStain. 抗體稀釋液或 TBST/5%NGS

檢測(cè)—檢測(cè)系統(tǒng)

傳統(tǒng)的 IHC 檢測(cè)方法利用了親和素和生物素間的天然親和性。這種親和素–生物素–復(fù)合物 (ABC) 系統(tǒng)需要進(jìn)行兩步法檢測(cè)：包括結(jié)合生物素化二抗后暴露于親和素–HRP 復(fù)合物，然后進(jìn)行顯色反應(yīng)?；谏锼氐南到y(tǒng)容易導(dǎo)致背景染色，特別是含有大量?jī)?nèi)源性生物素的肝臟、腎臟等組織。因此，我們建議使用基于聚合物的檢測(cè)系統(tǒng)，如 SignalStain. Boost IHC 檢測(cè)試劑。該基于聚合物的檢測(cè)系統(tǒng)不含生物素，而包含了直接偶聯(lián)于聚合物主鏈上的酶和二抗。SignalStain. Boost IHC 檢測(cè)試劑具有高敏感性并消除因內(nèi)源性生物素所致的假陽性染色，其檢測(cè)過程省去一個(gè)步驟為檢測(cè)過程節(jié)省了時(shí)間，并且其與所有基于過氧化物酶的底物相容。

抗體：Sox2 (D6D9) XP. Rabbit mAb #3579

樣本：石蠟包埋的人類肺部腫瘤

檢測(cè)：基于生物素的檢測(cè)或基于聚合物的檢測(cè)（SignalStain. Boost IHC Detection Reagent

色原

二氨基聯(lián)苯胺 (DAB) 底物是基于過氧化物酶檢測(cè)系統(tǒng)中常用的色原之一。DAB 與 HRP 反應(yīng)以在抗體結(jié)合處形成棕色沉淀物。在實(shí)驗(yàn)中建議始終使用高質(zhì)量的 DAB 底物。在 CST 公司，IHC 小組的 CST 科學(xué)家內(nèi)部鑒定 IHC 抗體所使用的都是 SignalStain. DAB 底物試劑盒。SignalStain. DAB 底物試劑盒敏感性高，且與一抗的作用效果。在 TBST 中清洗 3 x 5 分鐘（若為 IHC–F，則在 TBS 中清洗 3 x 5 分鐘），以清除未結(jié)合的二抗，隨后將 100–400μl SignalStain. DAB 應(yīng)用于每一個(gè)組織切片并密切監(jiān)控以得到合適的顯色。一般而言，1–10 分鐘即可獲得可接受的染色強(qiáng)度。獲得合適的染色強(qiáng)度后，將載玻片置于蒸餾水 (dH2O) 中以阻止進(jìn)一步顯色。

抗體：Phospho–Stat3(Tyr705)(D3A7) XP? Rabbit mAb

樣本：石蠟包埋的人類乳xian腫瘤

顯色檢測(cè)：利用 SignalStain? DAB Substrate Kit ，競(jìng)爭(zhēng)者提供的 DAB