我們知道流式實驗中抗體標記的數(shù)量越多得到的信息就越詳細和準確，以此同時，實驗操作也變得更加復雜。多色流式實驗中的補償操作，一直以來都是流式使用者非常關(guān)心的問題。甚至有人認為，由于目前熒光染料的光譜普遍比較寬，可能會在相鄰的多個通道都造成比較大的干擾，因此很難在流式上完成超過 18 色以上的實驗。事實是否真是這樣呢？恰巧哈佛醫(yī)學院附屬麻省總醫(yī)院的 Dr. Ravi Mylvaganam 與我們分享了他在 6 激光 21 色的 CytoFLEX LX 上做的一個多色實驗。我們一起來看看。

Dr. Ravi Mylvaganam 采用 20 個熒光抗體以及一個細胞死活染料組成 21 色的 panel，可同時檢測多群記憶、效應 T 細胞，調(diào)節(jié)性 T 細胞，NK 細胞甚至是干細胞樣 T 細胞等細胞亞群，詳細的抗體和染料標記如下所示：

實驗樣本準備步驟：

1. 標記一個樣本管，在管中添加 3 ?L 以下抗體：

1)    CD3 BUV395
2)    CD19 BUV496
3)    CD56 BUV737
4)    CD25 BV605
5)    CD95 BV650
6)    CD38 BV786
7)    CD16 PerCP
8)    CD4 PerCP-eFluor710
9)    CCR4 PE-TexasRed
10)    CCR7 PC7
11)    CD8 AF790

2. 添加 25 ?L Brilliant Stain Buffer，渦旋混勻 4 秒；然后加入 100 ?L 全血，再次渦旋混勻 4 秒后，在 37?C 下避光孵育 20 分鐘

3. 在試管中添加 5 ?L 以下抗體：

1)    CD57 Pacific Blue
2)    CD45 Krome Orange
3)    CD45 RA FITC
4)    CCR6 PE
5)    CD14 PC5
6)    PD-1 (CD279) PC5.5
7)    CD27 APC
8)    CD127 APC-A700
9)    CD28 APC-A750

4. 渦旋混合試管 4 秒后室溫避光孵育 20 分鐘

5. 在管中添加 1 mL VersaLyse 裂解液，渦旋混合 2～3 秒，室溫下避光孵育 15 分鐘

6 樣本 200 g 離心 5 分鐘，棄去上清液

7. 在試管中添加 5 ?L IR Fixable 染料，渦旋混合 2～3 秒，室溫下避光孵育 20 分鐘

8. 添加 2 mL PBS 重懸細胞，200 g 離心處理試管 5 分鐘，棄去上清液

9. 添加 0.9 ml PBS 和 0.1 ml IOTest3 固定液重懸細胞，可準備上機檢測

10. 同時按照上述的孵育、離心操作制備單染管

實驗結(jié)果如下

從實驗結(jié)果圖可以看出，這個 21 色方案的結(jié)果分群清晰，不論是常規(guī)的 CD3+CD4+Th 細胞還是含量較低的 Treg 或者干細胞樣 T 細胞，都能很好的檢測到，看來對于 CytoFLEX LX 而言，21 色實驗也不是一個難題。如果您需要該方案詳細的信息，可與我們聯(lián)xi。

多色補償問題的簡化，與流式細胞儀技術(shù)的發(fā)展密切相關(guān)。遙想小編當年，那個流式細胞儀用完后還要用紅布蓋起來的年代，我剛開始接觸的是一臺 4 色的流式，當時 4 色實驗就是「多色」實驗了！那時沒有離線補償也沒有自動補償，流式也沒做得那么頻繁，調(diào)補償是相當刺激的操作：先在 17 寸顯示屏上畫滿所有通道兩兩對應的散點圖，上樣之后一定要眼疾手快反應迅速默念「橫平豎直」，如果相關(guān)的門沒圈好，或者看到補償矩陣腦子蒙圈不知道調(diào)哪里，一著急就手足無措，經(jīng)常一管單染管跑完補償還沒調(diào)好所以實驗前師兄師姐往往要提醒「單染管多準備點樣本」……