RNA測序是遺傳學家工具箱中的一種常用工具。利用RNA測序，研究人員能夠定量地檢測各種生物體的基因表達，從而更好地了解細胞中正在發生的事情以及特定基因的功能。由于在藥物發現、疾病診斷和基因鑒定中具有潛在作用，RNA測序的應用似乎無極限。

RNA測序的準確性

早在2014年，《Nature Biotechnology》上發表了三篇文章。它們屬于RNA測序質量控制（SEQC）項目的一部分，旨在評估新一代測序平臺的性能以及RNA分析的優勢和局限。研究人員測試了三個常用RNA測序平臺的可靠性、準確性和信息內容，希望確定平臺的使用范圍并尋找變化的來源。

在整個研究過程中，三個研究機構都產生了超過10億個核苷酸的數據。他們還研究了30個不同的RNA測序實驗室所使用的技術以及數百名研究人員使用的生化方法。總的來說，他們認為RNA的提取和分析可以跨機構圓滿完成，即使樣本已嚴重降解，但是遺傳數據仍然可靠。

這些結果讓研究機構以及醫生患者放心，RNA測序是準確且可靠的。一項研究的負責人、梅奧診所的E. Aubrey Thompson評論道：“患者的護理決策似乎受到基因組數據的影響，而這些數據來源于患者樣本的RNA和DNA測序。如今我們知道了這些分析可在多大程度上依賴某個實驗室。”

生物實驗的重復性危機

如今，我們正處于所謂的重復性危機中，越來越多的研究變得難以重復，甚至不可能重復。據估計，單單就美國而言，每年花在無法重復的生物研究上的費用高達280億美元。除了經濟成本之外，不可重復的研究還造成藥物開發的延誤，阻礙疾病療法的開發。

在設計實驗和決定使用哪種技術時，重復性仍然是人們主要考慮的因素。可靠的方法通常是許多人的首-選，比如RNA測序。然而，以色列特拉維夫大學的研究人員開展的薈萃分析表明，RNA測序的數據分析過程中存在技術偏倚，可能造成數據的錯誤解釋和大量錯誤結果1。

RNA測序無法重復？

在分析了35個公開的RNA測序數據集之后，研究人員注意到某些基因反復呈現基因表達的變化。這些數據來自近年發表的人類和小鼠研究，覆蓋了多個生物過程。他們對此感到困惑，想了解這一現象背后究竟是真實的生物學現象，還是實驗過程引入的人為誤差。

在其中30個數據集中，研究人員發現特別長或特別短的基因往往表現出-明顯的基因表達水平變化。大多數短基因編碼了組成核糖體的蛋白質，而許多長基因則編碼了與細胞外基質有關的蛋白質。

經過進一步的研究，他們發現這種現象源于實驗的人為因素，而不是天然的生物反應。在比較相同條件下的重復樣本后，他們發現這種模式是由于技術偏倚，似乎與基因的長度有關。此外，若統計分析中存在缺陷，人們往往將檢測到的偏倚錯誤地標為細胞反應，特別是與核糖體或細胞外基質有關的反應。在許多常用的數據歸一化方法中，這種偏倚并未得到校正，因此可能已包含在許多數據集中。

這種效應被稱為樣本特異性長度效應（sample-specific length effect），之前已在文獻中提到過。許多研究人員已經意識到這一問題，但沒有積極地解決它。在此次分析的數據集中，未經校正的數據比例仍然很高。

不要低估統計分析的重要性

盡管乍一看讓人擔憂，但結果似乎也不是那么嚴重。在文中，研究人員還介紹了如何克服和消除這種偏倚，從而過濾掉錯誤的結果，保持生物學上的相關性。將基因長度視為樣本特異性的協變量，可以明顯減少假陽性結果的數量。

目前還不清楚哪些因素能夠淡化樣本特異性的長度效應，可能還需要進一步研究。作者建議研究人員在自己的研究中注意這種偏倚，并將建議的數據歸一化方法作為默認步驟，應用在RNA-seq數據分析的標準實踐中。

美國北卡羅來納大學教堂山分校的生物統計學家Michael Love表示：“這篇文章很好地證明了質量控制的重要性。”他指出，還有一些偏倚也會影響RNA測序數據的質量，比如GC含量偏倚，各個研究團隊在分析過程中應始終考慮這些因素。他本人并未參與此項研究。

這項研究強調稱，所有技術都不是100%可靠的，因為偏倚的可能性始終存在。隨著各個研究領域的重復性危機浮出水面并獲得關注，這項工作強化了準確開展統計分析的必要性。