胞嘧啶堿基編輯器（CBE）由胞嘧啶脫氨酶和nCas9蛋白融合組成。其中，經(jīng)典的胞嘧啶堿基編輯器BE4max CBE是由鼠源脫氨酶APOBEC1、nCas9蛋白和兩個尿嘧啶糖基化酶抑制劑構(gòu)成。該項研究基于結(jié)構(gòu)生物學改造了一類人源脫氨酶A3G, 并用其替代BE4max CBE中的鼠源脫氨酶，使A3G-CBE能夠-大程度地只編輯靶向堿基C而不影響與其緊鄰無關的C。

單堿基編輯面臨精度挑戰(zhàn)

與傳統(tǒng)基因編輯策略相比，基于CRISPR/Cas9系統(tǒng)的DNA單堿基編輯技術(shù)不會產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂, 因此避免了由易錯DNA修復通路所引入的隨機序列插入和刪除（Indels），從而極大地提高了編輯效率和產(chǎn)物純度，為基因編輯應用在遺傳疾病的基礎研究和治療帶來了曙光。

胞嘧啶堿基編輯器能夠在靶基因座上高效地進行胞嘧啶到胸腺嘧啶（C-to-T）的轉(zhuǎn)換，并已經(jīng)被用于相關疾病動物模型治療研究，例如糾正由地中海貧血癥。

“但是，單堿基編輯仍然面臨精度挑戰(zhàn)。”舉例說，當靶向堿基C緊鄰的堿基也是C時, 目前的CBE堿基編輯器很難區(qū)分它們。因為兩個相鄰的堿基C往往都會被編輯，從而無法達到精準糾正相關疾病的目的。這為使用CBE編輯器研究和治療此類遺傳疾病帶來了很大困難。

改造脫氨酶

之前研究表明，野生型的人源脫氨酶A3G主要對DNA單鏈5′-CCC-3′基因組序列中的第三個C產(chǎn)生脫氨基作用，即由C編輯為T。因此，這種選擇性有很大潛力被用于連續(xù)C區(qū)域的精確堿基編輯。

他們首先通過密碼子優(yōu)化，將野生型的A3G用于替換BE4 max中的鼠源脫氨酶rAPOBEC1，構(gòu)建出A3G-BE 2.1。

因為A3G 的N-端結(jié)構(gòu)域會導致A3G單體的聚集，并阻止A3G的脫氨活性；而A3G的C端結(jié)構(gòu)域本身足以脫氨。為了提高編輯效率，他們進一步構(gòu)建了只保留C端結(jié)構(gòu)域的A3G-BE 4.4。

在細胞中的測試結(jié)果顯示，A3G-BE 2.1和A3G-BE 4.4均可有效地區(qū)分連續(xù)C區(qū)域中的靶向C和無關C，而BE4 max則無選擇性地將兩個連續(xù)的C全部編輯。

為了進一步提高A3G-BE的編輯效率，他們通過分析A3G的C端結(jié)構(gòu)域中的關鍵氨基酸，設計了三組突變，分別用于加強脫氨催化活性，增加ssDNA結(jié)合親和性，提高蛋白質(zhì)溶解度。

而為了保留A3G的高選擇性，研究者同時又引入Y315F來提升非特異性DNA結(jié)合，從而終優(yōu)化得到了A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14。其中，A3G-BE5.13的堿基編輯活性稍高，A3G-BE5.14的選擇性稍高。“兩種新CBE可以在不同情形的多C編輯中互補。

準確性安全性俱佳

為了驗證改造后的A3G-BE，他們將A3G-BE 4.4、A3G-BE 5.13和A3G-BE 5.14用于在細胞系中構(gòu)建疾病模型和校正單堿基突變疾病，并與BE4max相比較。

結(jié)果顯示，改造后三種A3G-CBE能夠選擇性地對5′-CC-3′序列中第二個C而非第一個C進行編輯，明顯區(qū)分了靶向C和無關C，并生成了高占比的目標基因型，而BE4max則無法產(chǎn)生理想的靶向C編輯結(jié)果。

值得注意的是，A3G-BE5.14在生成轉(zhuǎn)甲狀腺素模型淀粉樣變的疾病模型的效率比BE4max 高613倍，更突出了其精確性的優(yōu)勢。

而在疾病模型的測試中，A3G-BE4.4以大于50%的靶向C編輯效率高效校正了導致全羧化酶合成酶缺乏癥的單堿基突變，并且沒有對鄰近無關的C產(chǎn)生編輯。其產(chǎn)生理想校正基因型的能力比BE4max高6496倍。

“與BE4max CBE相比，A3G-CBE在糾正相關單堿基突變疾病的能力提高得非常顯著。”

為了研究A3G-CBE的安全性，他們還通過RNA測序和全基因組測序進行脫靶編輯的表征。結(jié)果顯示，靶向編輯活性較高的A3G-BE 5.13與對照nCas9的脫靶水平相當，沒有顯著脫靶效應。

這些結(jié)果進一步證明，A3G-CBEs具有很高的應用價值，有很大希望被用于單堿基突變遺傳疾病的體內(nèi)治療研究。這項研究進一步加快了精準堿基編輯邁向臨床應用的步伐。