（一）概述

微載體培養(yǎng)技術于1967年被用于動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)。該技術目前已漸日趨完善和成熟，并廣泛應用于生產(chǎn)疫苗、基因工程產(chǎn)品等。

微載體培養(yǎng)是目前*的-有發(fā)展前途的一種動物細胞大規(guī)模培養(yǎng)技術，其兼具懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點，放大容易。

目前微載體培養(yǎng)廣泛用于培養(yǎng)各種類型細胞，生產(chǎn)疫苗、蛋白質產(chǎn)品，如293細胞、成肌細胞、Vero細胞、CHO細胞。

微載體是指直徑在60.250μm，能適用于貼壁細胞生長的微珠。一般是由天然葡聚糖或者各種合成的聚合物組成。自VanWezel用DEAE-SephadexA50研制的第一種微載體問世以來，市場上出售的微載體商品的類型已經(jīng)達十幾種以上，包括液體微載體、大孔明膠微載體、聚苯乙烯微載體、PHEMA微載體、甲殼質微載體、聚氨酯飽沫微載體、藻酸鹽凝膠微載體以及磁性微載體等。常用商品化微載體有三種：Cytodexl、2、3、Cytopore和Cytoline。

增大單位體積內表面積（S/F)對細胞的生長非常有利。微載體直徑盡可能小，-好控制在100-200μm之間。培養(yǎng)體系內微載體的密度一般為1.03-1.05g/cm2，隨著細胞的貼附及生長，密度可逐漸增大?？刂萍毎N壁的基本因素是電荷密度而不是電荷性質。若電荷密度太低，細胞貼附不充分，但電荷密度過大，反而會產(chǎn)生“毒性”效應。

（二）微載體培養(yǎng)原理與操作

1．微載體培養(yǎng)原理

將無細胞毒性的微載體顆粒加入到培養(yǎng)容器的培養(yǎng)液中，使細胞在微載休表面附著生長，同時通過持續(xù)攪動使微載體始終保持懸浮狀態(tài)。貼壁依賴性細胞在徽載體表面上的增殖，要經(jīng)歷戮附貼壁、生長和擴展成單層三個階段。細胞只有貼附在固體基質表面才能增殖，故細胞在微載體表面的貼附是進一步鋪展和生長的關鍵?；砀街饕强快o電引力和范德華力。細胞能否在微載體表面豁附，主要取決于細胞與微載體的接觸概率和相融性。

2．微載體培養(yǎng)操作

攪拌轉速由于動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，因而無法靠提高攪拌轉速來增加接觸概率。通常的操作是，在貼壁期采用低攪拌轉速，時攪時停。數(shù)小時后，待細胞附著于微載體表面時，維持設定的低轉速，進入培養(yǎng)階段。微載體培養(yǎng)的攪拌非常慢，大速度75r/min。

細胞與微載體的相融性好壞，與微載體表面的理化性質有關。一般細胞在進入生-理pH值時，表面帶負電荷。若微載體帶正電荷，則利用靜電引力可加快細胞貼壁速度。若微載體帶負電荷，因靜電斥力使細胞難于赫附貼壁，但培養(yǎng)液中溶有或微載體表面吸附著二價陽離子作為媒介時，則帶負電荷的細胞也能貼附。

影響細胞在微載體表面生長的因素很多，主要有三個方面：①培養(yǎng)細胞方面，如細胞群體、狀態(tài)和類型。②微載體特性方面，如微載體表面狀態(tài)、吸附的大分子和離子。徽載體表面光滑時細胞擴展快，表面多孔則擴展慢。③培養(yǎng)液組成及其特性，如培養(yǎng)基組成、沮度、pH、DO以及代謝廢物等均明顯影響細胞在微載體上的生長。如果所處條件-優(yōu)，則細胞生長快，反之生長速度慢。

微載體培養(yǎng)操作要點：①培養(yǎng)初期。保證培養(yǎng)基與微球體處于穩(wěn)定的pH與溫度水平，接種對數(shù)生長中晚期細胞至終體積1/3的培養(yǎng)液中，以增加細胞與微載體接觸的機會。不同的微載體所用濃度及接種細胞密度是不同的。常使用2-3g/L的微載體含量，更高的微載體濃度需要控制環(huán)境或經(jīng)常換液。②貼壁階段。3-8d后，緩慢加入培養(yǎng)液至工作體積，并且增加攪拌速度保證*均質混合。③培養(yǎng)維持期。進行細胞計數(shù)、葡萄糖測定及細胞形態(tài)鏡檢。隨著細胞增殖，微球變得越來越重，需增加攪拌速率。經(jīng)過3d左右，培養(yǎng)液開始呈酸性，需換液。換液時，停止攪拌，讓微珠沉淀5min，棄掉適宜體積的培養(yǎng)液，緩慢加入37℃新鮮培養(yǎng)液，重新開始攪拌。④收獲細胞。首先排干培養(yǎng)液，至少用緩沖液漂洗1遍，然后加入相應的酶，75-125r/min快速攪拌20-30min。然后解離收集細胞及其產(chǎn)品。

可以通過增加微載體的含量或培養(yǎng)體積進行微載體培養(yǎng)的放大。使用異倍體或原代細胞培養(yǎng)生產(chǎn)疫苗、干擾素，已被放大至4000L以上。

（三）微載體培養(yǎng)的優(yōu)點

微載體培養(yǎng)由于表面積／體積（S/V）大，因此單位體積培養(yǎng)液的細胞產(chǎn)率高。把懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)融合在一起，兼有兩者的優(yōu)點?？捎煤唵蔚娘@微鏡觀察細胞在微珠表面的生長情況。簡化了細胞生長各種環(huán)境因素的檢測和控制，重現(xiàn)性好。培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的利用率較高。容易放大，細胞收獲過程不復雜，勞動強度小，培養(yǎng)系統(tǒng)占地面積小。