凝膠過濾層析又稱凝膠排阻色譜, 分子篩色譜法, 凝膠過濾法等。利用凝膠過濾介質為固定相，根據物料中溶質相對分子質量的差異的液相色譜法。只依據尺寸大小分離，大組分最先被洗提出。色譜固定相是多孔性凝膠，只有直徑小于孔徑的組分可以進入凝膠孔道。大組分不能進入凝膠孔洞而被排阻，只能沿著凝膠粒子之間的空隙通過，因而最大的組分最先被洗提出來。小組分可進入大部分凝膠孔洞，在色譜柱中滯留時間長，會更慢被洗提出來。溶劑分子因體積最小，可進入所有凝膠孔洞，因而是最后從色譜柱中洗提出。這也是與其他色譜法最大的不同。
凝膠過濾層析常見問題解答：
1. 色譜峰對稱性差
出峰上升時，上升緩慢是填料裝填過緊，而拖尾是因為裝填的太松，此時對稱因子及柱效都很差，出現這種情況就要重現裝柱。裝柱前要了解填料的壓縮系數(壓縮因子)如Focurose FF系列的填料的壓縮系數是1.15，且裝完后要測柱效。
2. 柱床有裂縫或干涸等塌柱現象
檢測管路及柱床體系是否有泄露或氣泡，必要時重現裝柱。
3. 分離度差
(1) 樣品和選擇的填料不匹配
待分離的樣品中目標物質和其它雜質的分子量小于2倍且都在選擇的填料的排阻極限之外或者之內。若樣品中目標物質的分子量和其它雜質的分子量小于2倍時，建議嘗試其它方法分離，反之選擇凝膠過濾層析時，填料的選擇應根據樣品中目標分子的大小選擇最接-近(大或小都可以)目標分子排阻極限的填料進行分離。
(2) 柱床裝填的效果差
通過測柱效等方式確保柱床裝填的滿足凝膠過濾層析的過程。
(3) 上樣量過大
根據樣品中目標物質和雜質的分子差異優化上樣量，如脫鹽等樣品中目標分子和雜質的分子量大于50倍時，上樣量可以達到柱床體積的25%，最高不超過30%，若樣品中目標分子和雜質的分子量差異在2-5倍時，通常上樣量控制在柱床體積的5%以內。
(4) 流速過快
凝膠過濾的過程流速不宜過快，降低流速在一定程度上可以提高分離度。
(5) 層析填料被污染或老化
隨著填料的使用，一些雜質的積累會使層析填料的孔徑發生變化(如堵塞，非特異性吸附積累，微生物污染，破碎等)，導致其排阻能力發生偏差而影響分離度。此時可對填料進行CIP清洗，若清洗后還不能達到分離要求，就要更換新的填料。
(6) 樣品自身的問題
樣品粘度過大也會導致分離度下降，粘度大的樣品在凝膠過濾時要對其進行稀釋處理在凝膠過濾；
樣品中目標物質和其它雜質的非特異性結合或者作用力，此時就要嘗試添加一些添加劑(如2%的Triton x-100,150mM NaCl等)，減少樣品中各組份之間的作用力；
樣品的pH，離子強度對某些填料的柱床體積會產生一些影響，也會影響分離度，必要時可以優化樣品的緩沖液。
4、反壓大，液流慢
凝膠過濾層析柱的裝填應控制在60-100cm，太低影響分離度，太高反壓增大。另外填料的清潔程度及樣品的粘度，pH，離子強度也會影響液流速度。
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