小鼠糖化血清蛋白(GSP)ELISA試劑盒操作步驟

　　本試劑僅供研究使用目的：本試劑盒用于測定小鼠血清，血漿，細胞上清及相關液體樣本中小鼠糖化血清蛋白(GSP)的含量。

　　實驗原理：

　　本試劑盒應用雙抗體夾心法測定標本中小鼠糖化血清蛋白(GSP)水平。用純化的小鼠糖化血清蛋白(GSP)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入糖化血清蛋白(GSP)，再與HRP標記的糖化血清蛋白(GSP)抗體結合，形成抗體-抗原-酶標抗體復合物，經過洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，并在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的糖化血清蛋白(GSP)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度(OD值)，通過標準曲線計算樣品中小鼠糖化血清蛋白(GSP)濃度。

　　試劑盒組成：

　　試劑盒組成48孔配置96孔配置保存

　　說明書1份1份

　　封板膜2片(48)2片(96)

　　密封袋1個1個

　　酶標包被板1×481×962-8℃保存

　　標準品：720ng/L0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

　　標準品稀釋液1.5ml×1瓶1.5ml×1瓶2-8℃保存

　　酶標試劑3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　樣品稀釋液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　顯色劑A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　顯色劑B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

　　濃縮洗滌液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存

　　樣本處理及要求：

　　1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如出現沉淀，應再次離心。

　　2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應該再次離心。

　　3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

　　4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS(PH7.2-7.4)稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反復凍融，以使細胞破壞并放出細胞內成份。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應再次離心。

　　5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS(PH7.4)，用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右(2000-3000轉/分)。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

　　6. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融.

　　7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　操作步驟：

　　標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然后在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻;然后從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻;然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻;混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。(稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為480 ng/L，320ng/L ，160 ng/L，80ng/L，40ng/L)。

　　加樣：分別設空白孔(空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同)、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品10μl(樣品最終稀釋度為5倍)。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

　　溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。

　　配液：將30(48T的20倍)倍濃縮洗滌液用蒸餾水30(48T的20倍)倍稀釋后備用。

　　洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

　　加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

　　溫育：操作同3。

　　洗滌：操作同5。

　　顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

　　終止：每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。

　　測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

　　注意事項：

　　試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

　　濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

　　各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

　　請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高(樣本OD值大于標準品孔第一孔的OD值)，請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(n倍)后再測定，計算時請最后乘以總稀釋倍數(×n×5)。

　　封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

　　底物請避光保存。

　　嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

　　所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

　　本試劑不同批號組分不得混用。

　　10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

　　計算：

　　以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，

　　在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD

　　值由標準曲線查出相應的濃度;再乘以稀釋

　　倍數;或用標準物的濃度與OD值計算出標

　　準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值

　　代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

　　倍數，即為樣品的實際濃度。

　　試劑盒性能：

　　1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.990以上。

　　2.批內與批見應分別小于9%和11%

　　檢測范圍：

　　20ng/L -700ng/L

　　保存條件及有效期：

　　1.試劑盒保存：;2-8℃。

　　2.有效期：6個月

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