免疫熒光(immunofluorescence，IF)，通常是指用熒光標記的抗體示蹤或檢查樣品中相應抗原的方法。根據(jù)抗原抗體反應，將不影響抗原抗體相互作用的熒光分子標記在抗體上，與其相應的抗原反應后，在熒光顯微鏡下針對熒光標記分子的激發(fā)光發(fā)射光進行觀察，從而檢測目的指標的相對含量、在組織細胞中的定位。

產(chǎn)品名稱：六色多重免疫熒光試劑盒(五標六色)
原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA， Tyramide signal amplification)技術是一類利用辣根過氧化酶          （ HRP） 對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法， 類似常規(guī)免疫組化的 DAB 顯色方法 ， TSA 技術同樣采 用 HRP 標記的二抗， 同樣有對應的 “顯色"步驟 （HRP 催化加入反應體系的酪胺熒光素底物， 產(chǎn)生  活化熒光底物， 活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結合， 使樣品上穩(wěn)定的共價結合酪胺熒光    素。之后用熱修復法洗去非共價結合的一抗-二抗-HRP 復合物， 重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵 育， 換另一種酪胺熒光素底物， 如此往復就可實現(xiàn)多重標記。
TSA 詳細原理是利用酪胺 Tyramide的過氧化物酶反應(酪胺鹽在 HRP 催化 H202 下形成共價鍵結
合位點)， 產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物， 該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、  組氨s和酪氨s殘基)結    合， 這樣在抗原-抗體結合部位就有大量的熒光素沉積， 結果使其檢測信號得到 10-100 倍增強。  簡單  來說， 用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的 HRP （而不是直接偶聯(lián)熒光素） ， 來催化后續(xù) 添加入體系的非活性熒光素。  熒光素在 HRP 和過氧化氫的作用下被活化， 跟臨近蛋白的酪氨s殘基    共價偶聯(lián)， 使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結合。  然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價 結合的抗體被洗掉， 共價結合的熒光素穩(wěn)定共價結合在樣本切片蛋白上。  再換個一抗來第二輪孵育 ， 周而復始。  等到所有抗體孵育結束， 熒光素都結合好后， 最后去檢測結果。  由于每次體系中都只有單 一抗體孵育， 因此無需擔心抗體交叉反應， 以及一抗二抗種屬匹配問題， 大大減少了實驗設計時不同 種屬抗體選擇匹配的限制。  也就是說， 如果用 TSA 技術， 同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性 高的兔單克隆抗體。  搭配同一支抗兔的 HRP 二抗就可以進行實驗， 而且信號放大的倍數(shù)大大增強。    本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中以下一種或者多種：  480， 520，   570， 620， 690， 780。 此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。  可以實現(xiàn)單標、  雙  標、 三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能， 極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。
產(chǎn)品名稱：六色多重免疫熒光試劑盒(五標六色)
試劑盒組成： 520 熒光染料(綠光)(即用型， 5mL),-20℃；  570 熒光染料 （紅光）  (即用型， 5mL)， -20℃；  620 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃；  690 熒光染料 (即用型， 5mL)， -    20℃；   780 熒光染料 (即用型， 5mL)， -20℃；  TSA+增強劑， 100ul，  -20℃ （可選） ；

高敏多聚 hrp 山羊抗兔二抗 （15mL） 4℃ （可選）  。
備注：  520 熒光染料 、570 熒光染料、  620 熒光染料、  690 熒 光染料、  780 熒光染料 在-20 度下， 均為固體， 使用之前需解凍。

TSA+增強劑使用方法：  TSA+增強劑能夠進一步增強熒光信號放大液的放大信號 5-10 倍， TSA+增 強劑：   熒光放大液=1:500， 使用 TSA+增強劑不是必須的選項， 可以根據(jù)具體的情況選擇添加 或者不選擇添加。

產(chǎn)品名稱：六色多重免疫熒光試劑盒(五標六色)
操作流程：
1、 石蠟切片脫蠟至水：  依次將切片放入二甲苯 Ⅰ 15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇 Ⅰ5min-無水乙醇 Ⅱ。 取出放在通風廚內(nèi)，酒精晾干后放入自來水中稍洗， 蒸餾水洗。
2、 抗原修復：  組織切片置于盛滿 PH 9.0 EDTA 堿性抗原修復液或者 PH6.0 檸檬酸修復緩沖液的修復 盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復 （也可以用高壓 1-2min 100 度水煮 15min 95 度水浴 20min等其他 熱修復方法）  。 中火 8min， 停火 8min， 轉中低火 7min， 此過程中應防止緩沖液過度蒸發(fā)， 切勿 干片。  自然冷卻后將玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 (修復液 和修復條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定）  。
3 、 阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：  切片放入 3%過氧化氫r液， 室溫避光孵育 15 min， 將玻片置于 PBS （PH7.4） 中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。
4、 BSA 封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈 （防止抗體流走） ， 在圈內(nèi)滴加用 3%BSA-PBS （或者其他封閉液） 均勻覆蓋組織， 室溫封閉 30min。
5、 加一抗：  輕輕甩掉封閉液， 在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗 X，切片平放于避光濕盒 內(nèi) 4°C 孵育過夜或者 37 度 1-2h。 （濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā)）
6、 加 hrp 二抗：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次，每次 5min。 切片稍甩干后 在圈內(nèi)滴加與一抗相應種屬的hrp二抗覆蓋組織， 避光室溫孵育 50min， PBS 洗三次。
7、 熒光染料反應：  XXX 熒光染料反應 10-15min， PBS 洗三次。
8、 重復 2-7 步驟 （換用另外一種 XXX 熒光染料）
9、 DAPI 復染細胞核：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌 3 次， 每次 5min。 切片稍 甩干后在圈內(nèi)滴加 DAPI 染液， 避光室溫孵育 10min。
10、    封片：  玻片置于 PBS（PH7.4）中在脫色搖床上晃動洗滌3 次， 每次 5min。 切片稍甩干后用抗 熒光淬滅封片劑封片。
11、    鏡檢拍照：  切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖 像。