七色多重熒光染色試劑盒(六標七色)技術(shù)資料

　　原理介紹: 酪酰胺信號放大(TSA，Tyramide signal amplification)技術(shù)是一類利用辣根過氧化酶(HRP)對靶蛋白進行標記的酶學檢測方法，類似常規(guī)免疫組化的DAB顯色方法 ，TSA技術(shù)同樣采用HRP標記的二抗，同樣有對應(yīng)的“顯色"步驟(HRP催化加入反應(yīng)體系的酪胺熒光素底物，產(chǎn)生活化熒光底物，活化底物可與抗原上的酪氨s等殘基共價結(jié)合，使樣品上穩(wěn)定的共價結(jié)合酪胺熒光素。之后用熱修復法或者抗體洗脫液洗去非共價結(jié)合的一抗-二抗-HRP復合物，重復下一種一抗-hrp二抗來第二輪孵育，換另一種酪胺熒光素底物，如此往復就可實現(xiàn)多重標記。

　　TSA詳細原理是利用酪胺Tyramide的過氧化物酶反應(yīng)(酪胺鹽在HRP催化H202下形成共價鍵結(jié)合位點)，產(chǎn)生大量的酶促產(chǎn)物，該產(chǎn)物能與周圍的蛋白殘基(包括色氨s、組氨s和酪氨s酸殘基)結(jié)合，這樣在抗原-抗體結(jié)合部位就有大量的熒光素沉積，結(jié)果使其檢測信號得到10-100倍增強。簡單來說，用這種方法做多重免疫熒光是利用二抗上帶有的HRP(而不是直接偶聯(lián)熒光素)，來催化后續(xù)添加入體系的非活性熒光素。熒光素在HRP和過氧化氫的作用下被活化，跟臨近蛋白的酪氨s殘基共價偶聯(lián)，使得蛋白樣品與熒光素穩(wěn)定結(jié)合。然后微波或煮沸或者水浴等熱修復處理，前一輪非共價結(jié)合的抗體被洗掉，共價結(jié)合的熒光素穩(wěn)定共價結(jié)合在樣本切片蛋白上。再換個一抗來第二輪孵育，周而復始。等到所有抗體孵育結(jié)束，熒光素都結(jié)合好后，最后去檢測結(jié)果。由于每次體系中都只有單一抗體孵育，因此無需擔心抗體交叉反應(yīng)，以及一抗二抗種屬匹配問題，大大減少了實驗設(shè)計時不同種屬抗體選擇匹配的限制。也就是說，如果用TSA技術(shù)，同一張片子上所有的靶標都可以選用特異性高的兔單克隆抗體。搭配同一支抗兔的HRP二抗就可以進行實驗，而且信號放大的倍數(shù)大大增強。本公司開發(fā)的試劑盒具體酪胺熒光染料為以下其中一種或者多種：TYR-480Plus，TYR-520Plus，TYR-570Plus，TYR-620Plus，TYR-690Plus，TYR-780Plus。此試劑盒中的熒光染料可單獨或配合使用。可以實現(xiàn)單標、雙標、三標以及更多重熒光放大/多重同源抗體熒光標記等功能，極大豐富了此試劑盒的內(nèi)涵。

　　試劑盒規(guī)格：100T

　　儲存溫度：4度，一年有效

　　試劑盒組成：

　　名稱貨號規(guī)格保存條件

　　TYR-480 Plus 熒光染料RC006濃縮型，50ul，200x4℃

　　TYR-520 Plus 熒光染料RC001濃縮型，50ul，200x4℃

　　TYR-570Plus 熒光染料RC002濃縮型，50ul，200x4℃

　　TYR-620Plus 熒光染料RC003濃縮型，50ul，200x4℃

　　TYR-690Plus 熒光染料RC004濃縮型，50ul，200x4℃

　　TYR-780Plus 熒光染料RC005濃縮型，50ul，200x4℃

　　TSA bufferRCB008636mL4℃

　　HRP山羊抗兔/鼠通用二抗RCB05436mL4℃

　　Dapi染液(即用型)RC0510mL4℃

　　抗體稀釋液RCT00250mL4℃

　　3%過氧化氫RC01250mL4℃

　　染料使用方法：TSA熒光染料反應(yīng)液 =TYR-xxxPlus 熒光染料+TSA buffer;TYR-xxxPlus 熒光染料：TSA buffer=1：200;TYR-xxxPlus 熒光染料與TSA buffer的稀釋比例可以根據(jù)具體情況靈活調(diào)整優(yōu)化，最佳范圍為1:50--1:400(1:200大部分情況能得到最佳結(jié)果);一般建議若一抗孵育時間常溫1h-3h內(nèi)，建議稀釋比例1:50-1:200, 若一抗孵育時間4度過夜(12h或以上)，建議稀釋比例1:200-1:400或更高。

　　操作流程簡圖：

　　詳細操作步驟

　　1、樣本準備：

　　1)石蠟切片：依次將切片放入二甲苯Ⅰ15min-二甲苯Ⅱ15min-無水乙醇Ⅰ5min-無水乙醇Ⅱ5min-95%乙醇5min-85%乙醇5min-75%乙醇5min，蒸餾水洗。

　　2)冰凍切片：冰凍切片固定10-30min，PBS洗5min，重復3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重復3次。

　　3)細胞爬片或者細胞涂片：細胞樣本固定10-30min，PBS洗5min重復3次，滴加0.3% triton-X100破膜液通透20min，PBS洗5min，重復3次。

　　2、抗原修復：組織切片置于盛滿PH 9.0 EDTA堿性抗原修復液或者PH6.0檸檬酸修復緩沖液的修復盒中于微波爐內(nèi)進行抗原修復(也可以用高壓1-2min 100度水煮15min 95度水浴20min等其他熱修復方法)。中火8min，停火8min，轉(zhuǎn)中低火7min，此過程中應(yīng)防止緩沖液過度蒸發(fā)，切勿干片。自然冷卻后將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。(修復液和修復條件根據(jù)組織類型以及抗原類型來確定，冰凍切片和細胞樣本可省略此步驟)。

　　3、阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化q溶液，室溫避光孵育15 min，將玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。

　　4、非特異性靶點封閉:切片稍甩干后用組化筆在組織周圍畫圈(防止抗體流走)，在圈內(nèi)滴加用抗體稀釋液(或者其他封閉液 3%BSA 或者山羊血清)均勻覆蓋組織，室溫封閉30min。額外說明：抗體稀釋液內(nèi)含有各種保護劑以及防腐劑，可以用來封閉或者稀釋一抗，稀釋后的一抗可以長期四度保存(在常溫下也可以保存一個月之久)

　　5、加一抗：輕輕甩掉封閉液，在切片上滴加用抗體稀釋液稀釋好的的一抗X，切片平放于避光濕盒內(nèi)4°C孵育過夜或者37度1-2h(濕盒內(nèi)加少量水防止抗體蒸發(fā));

　　6、加hrp二抗：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加與一抗相應(yīng)種屬的hrp二抗覆蓋組織，避光室溫孵育50min，PBS洗三次。額外說明：本試劑盒內(nèi)自帶的hrp山羊抗兔/鼠通用二抗為即用型，具有超高靈敏度，隨時可用，無需配置。

　　7、TSA熒光染料反應(yīng)液反應(yīng)：濃縮型熒光染料與TSA buffer按照1:50-1:200的比例混合均勻，切片滴加配好的TSA熒光染料反應(yīng)液均勻覆蓋組織室溫反應(yīng)1-15min(最佳時間5min-10min)，PBS洗三次(預(yù)實驗可先染1min洗干凈熒光染料后顯微鏡下觀察染色效果，如果陽性弱繼續(xù)滴加熒光染料加強染色強度直至合適強度后繼續(xù)進行下一步)。

　　8、抗體洗脫：石蠟切片置于抗原修復液中95度水浴25-40min(根據(jù)不同抗體親和力 靈活調(diào)整時間)或者滴加適量37度預(yù)熱至溶解的mIHC專用抗體洗脫液(冰凍切片爬片骨組織建議用)覆蓋樣本，37度放置5-20分鐘，棄去洗脫液，再次滴加適量抗體洗脫液覆蓋樣本37度放置5-20分鐘，棄洗脫液，PBS洗三次，每次5分鐘(石蠟切片可用熱修復洗脫或者抗體洗脫液洗脫，細胞及冰切切片需用抗體洗脫液進行洗脫)

　　9、 重復3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第二輪標記

　　10、重復3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第三輪標記

　　11、重復3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第四輪標記

　　12、重復3-8步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第五輪標記

　　13、重復3-7步驟(換用另外一種TYR-XXXPLus 熒光染料)---第六輪標記

　　14、DAPI復染細胞核：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后在圈內(nèi)滴加DAPI即用型染液，避光室溫孵育5min-20min。

　　15、封片：玻片置于PBS(PH7.4)中在脫色搖床上晃動洗滌3次，每次5min。切片稍甩干后用抗熒光淬滅封片劑封片(我司有相應(yīng)產(chǎn)品)。

　　16、鏡檢拍照：切片于熒光顯微鏡/共聚焦/多通道熒光掃描儀/多光譜成像系統(tǒng)下觀察并采集圖像。

　　染料激發(fā)波長發(fā)射波長

　　DAPI 藍色350420

　　TYR-480Plus450480

　　TYR-520Plus綠色490520

　　TYR-570Plus紅色550570

　　TYR-620Plus590620

　　TYR-690Plus630690

　　TYR-780Plus750780

　　文章引用試劑盒/方法：Co-staining of A and B was performed using a Seven color mIHC Fluorescence kit ( Recordbio Biological Technology, Shanghai, China) based on the tyramide signal amplification (TSA) technology according to the manufacture’s instruction.

　　七色多重熒光染色試劑盒 上海古朵生物科技有限公司成立于上海浦東新區(qū)。是一家專門從事生物技術(shù)相關(guān)產(chǎn)品，勵志研發(fā)和銷售的綜合性生物公司，產(chǎn)品遠銷多個國家和地區(qū)，我們將一如既往地秉承“一切為了滿足客戶的需求"的經(jīng)營宗旨;牢固樹立“以客戶需求為準則、以市場需求為導向，不斷開發(fā)高質(zhì)量的新產(chǎn)品，提供客戶滿意的綜合服務(wù)質(zhì)量"的方針。