大鼠IV型膠原酶(COL-IV)酶聯免疫檢測試劑盒使用說明書

　　本酶聯免疫試劑盒是基于雙抗體夾心技術原理，來檢測大鼠IV型膠原酶(COL-IV)，只能用于研究用途，不得用于醫學診斷。

　　用 途：用于大鼠血清、血漿及相關液體樣本中IV型膠原酶(COL-IV)測定。

　　工作原理:

　　本試劑盒采用的是生物s雙抗體夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)測定樣品中大鼠IV型膠原酶(COL-IV)水平。向預先包被了大鼠IV型膠原酶(COL-IV)單克隆抗體的酶標孔中加入大鼠IV型膠原酶(COL-IV)，溫育;溫育后，加入生物s標記的抗IV型膠原酶(COL-IV)抗體。再與鏈霉親和素-HRP結合，形成免疫復合物，再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶，然后加入底物A、B，產生藍色，并在酸的作用下轉化成終的黃色。顏色的深淺與樣品中大鼠IV型膠原酶(COL-IV)的濃度呈正相關。

　　試劑盒組成:

　　試劑盒組成48孔配置96孔配置保存

　　說明書1份1份

　　封板膜2片(48)2片(96)

　　密封袋1個1個

　　酶標包被板1×481×962-8℃保存

　　標準品12ng/ml0.5ml×1瓶0.5ml×1瓶2-8℃保存

　　標準品稀釋液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

　　鏈霉親和素-HRP3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　生物s標記的抗COL-IV抗體0.5ml×1瓶1 ml×1瓶2-8℃保存

　　顯色劑A液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　顯色劑B液3 ml×1瓶6 ml×1瓶2-8℃保存

　　終止液3ml×1瓶6ml×1瓶2-8℃保存

　　濃縮洗滌液(20ml×20倍)×1瓶(20ml×30倍)×1瓶2-8℃保存

　　需要而未提供的試劑和器材:

　　37℃恒溫箱。

　　標準規格酶標儀。

　　精密移液器及一次性吸頭

　　蒸餾水，

　　一次性試管

　　吸水紙

　　注意事項:

　　從2-8℃取出的試劑盒，在開啟試劑盒之前要室溫平衡至少30分鐘。酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

　　各步加樣均應使用加樣器，并經常校對其準確性，以避免試驗誤差

　　嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.

　　為避免交叉污染，要避免重復使用手中的吸頭和封板膜。

　　不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

　　底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。

　　洗板方法:

　　手工洗板方法：甩掉酶標板內的液體;在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次;將稀釋后的洗滌液至少0.35ml注入孔內，浸泡1-2分鐘。根據需要，重復此過程數次。

　　自動洗板：如果有自動洗板機，應在熟練使用后再用到正式實驗過程中

　　標本要求:

　　1.不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的(HRP)活性。

　　2.標本采集后盡早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應避免反復凍融。

　　操作程序:

　　標準品的稀釋：(本試劑盒提供原倍標準品一支，用戶可按照下列圖表在小試管中進行稀釋。)

　　6ng/ml5號標準品120μl的原倍標準品加入120μl標準品稀釋液

　　3ng/ml4號標準品120μl的5號標準品加入120μl標準品稀釋液

　　1.5ng/ml3號標準品120μl的4號標準品加入120μl標準品稀釋液

　　0.75ng/ml2號標準品120μl的3號標準品加入120μl標準品稀釋液

　　0.375ng/ml1號標準品120μl的2號標準品加入120μl標準品稀釋液

　　根據待測樣品數量加上標準品的數量決定所需的板條數。每個標準品和空白孔建議做復孔。每個樣品根據自己的數量來定，能使用復孔的盡量做復孔。

　　加樣：1)空白孔，空白對照孔不加樣品，生物s標記的抗COL-IV抗體，鏈霉親和素-HRP，只加顯色劑A&B和終止液，其余各步操作相同;2)標準品孔：加入標準品50ul，鏈霉親和素-HRP50ul(標準品中已事先整合好生物s抗體，故不加);3)待測樣品孔：加入樣本40ul，然后各加入抗COL-IV抗體10ul、鏈霉親和素-HRP50ul，蓋上封板膜，輕輕震蕩混勻，37℃溫育60分鐘。

　　配液：將30倍濃縮洗滌液用蒸餾水30倍稀釋后備用。

　　洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復5次，拍干。

　　顯色：每孔先加入顯色劑A50ul，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

　　終止：每孔加終止液50μl，終止反應(此時藍色立轉黃色)。

　　測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。 測定應在加終止液后10分鐘以內進行。

　　根據標準品的濃度及對應的OD值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據樣品的OD值在回歸方程上計算出對應的樣品濃度。也可以使用各種應用軟件來計算。

　　操作程序總結：

　　試劑盒性能：

　　1.樣品線性回歸與預期濃度相關系數R值為0.92以上。

　　2.批內與批間應分別小于9%和15%

　　檢測范圍：

　　檢測范圍：0.2ng/ml - 9 ng/ml

　　保存條件及有效期：

　　保存：2-8℃。

　　有效期：6個月(2-8℃)。

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