細胞凍存和復蘇你應該知道的小細節

　　在細胞培養檢測實驗在實驗儀器等工作上都要耗費不少的人力和體力。好在很久以前就有高人發明了細胞保存這個實驗步驟，將暫時多出來的細胞冰凍保存，保存細胞活力。細胞復蘇是一個簡單的試驗操作，但操作中也有許多需要注意的事項，在實驗操作中注意細小的問題，才能使復蘇后的細胞保持良好的狀態，針對細胞復蘇應該注意以下幾點：

　　1. 可以提前把需要的體積的培養液放到培養瓶里，擰松瓶蓋，放到孵箱里30分鐘--1個小時;

　　2. 為防止凍存管在升溫時出現爆裂等情況，可以在放入水浴前就把超凈臺里的蓋子擰松一下然后再擰上;

　　3. 水浴溫度37℃左右。

　　一、慢凍程序

　　1. 標準程序：采用細胞凍存器

　　當溫度在-25 ℃以上時，1~2 ℃/min;

　　當溫度達-25 ℃以下時，5~10 ℃/min;

　　當溫度達-100℃時，可迅速放入液氮中。

　　2. 簡易程序：將冷凍管(管口要朝上)放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降1~2 ℃的速度，在40 min內降至液氮表面過夜，次日早晨投人液氮中。

　　3. 傳統程序：冷凍管置于4℃ 10 分鐘→ -20℃ 30 分鐘→ -80℃ 16~18 小時(或隔夜) → 液氮槽長期儲存。

　　二、低溫保護劑的應用

　　在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。

　　常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。

　　三、保存細胞的復蘇方法

　　1. 快速解凍

　　凍存細胞從液氮中取出后，立即放入37℃水浴中，輕輕搖動冷凍管，使其在1 分鐘內全部融化(不要超過3 分鐘)。

　　2. 解凍后的細胞可直接接種到生長培養液的細胞培養瓶中直接進行培養，24小時后再用新鮮培養液替換舊培養液，以去除DMSO。

　　3. 如果細胞對冷凍保護劑特別敏感

　　解凍后的細胞應先通過離心去除冷凍保護劑，然后再接種到生長培養液的培養瓶中。

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