濰坊日麗環保閆雪為您簡介生活污水處理工藝對雌激素效應的影響

　內分泌干擾物被定義為一類能夠干擾或抑制生物體內分泌、神經、免疫和系統功能, 并產生可逆或不可逆性生物學效應的外源性物質.在自然界中內分泌干擾物以多種形式存在，據報道超過8 700種物質具有內分泌干擾效應.內分泌干擾物主要包括固醇類激素、表面活性劑、工業合成物等.例如，雌酮 (E1)、雌二醇 (E2)、雌三醇 (E3) 是人和動物排泄物中主要的天然雌激素. 17α-乙炔基雌二醇 (EE2) 作為口服藥的主要成分，則是合成類固醇激素的主要形式.由于污水處理工藝并不能將內分泌干擾物*去除，污水處理廠出水成為自然水體中內分泌干擾物的主要來源之一.另外，由于內分泌干擾物具有一定的親脂性，其很容易在水生生物和低泥中富集，給水生生物帶來一定的危害.一些研究表明水環境中的內分泌干擾物可導致魚類體內卵黃原蛋白上升、雄魚雌性化等.因此，檢測城市污水的雌激素水平和干擾效應，并分析研究不同處理工藝的去除效果，對水環境的生態安全評價具有重要意義.

　　通常，人們采用化學分析法對水環境中雌激素物質進行定性或者定量分析，例如高效液相色譜、氣相色譜、高效液相色譜-質譜法等.但這些化學分析法需要較高的成本和熟練的操作技能.此外，水環境的雌激素物質會產生拮抗、協同或者加和作用，而化學分析法無法反映化合物之間的相互作用，故其不能表明水環境雌激素物質的潛在效應.生物檢測可反映水環境中化合物的綜合生物效應.因此，有必要利用生物毒性檢測法對水環境的雌激素效應進行評價.重組酵母菌法是常用的檢測水環境雌激素活性的手段.其基本原理是雌激素物質能夠和酵母菌攜帶的人體雌激素受體形成復合物，通過促進報告基因LacZ的表達，產生β-半乳糖苷酶，測定β-半乳糖苷酶的活性即可反映樣品的雌激素活性，它具有靈敏度高、省時、成本低等優點.重組酵母菌法被廣泛用于水樣、污泥、底泥以及家庭灶爐等燃燒過程中排放的污染物的雌激素活性.酶聯免疫吸附法 (enzyme linked immunosorbent assay，ELSIA) 則是基于抗原-抗體的特異性反應的原理，通過酶作用于底物后的顯色來進行定量.傳統上其主要用來檢測細胞和血液中雌激素含量.酶聯免疫吸附法需要的樣品量少，不需要復雜的預處理，具有操作簡單、節約時間和成本、可用于多種毒性指標檢測的優點.目前，ELISA逐漸被用于水環境、土壤和低泥中雌激素物質的檢測.因此，本研究的主要目的是利用重組酵母菌法和酶聯免疫法分別對不同處理工藝的生活污水的雌激素活性和E2水平進行檢測和評價，并將兩個檢測方法進行比較，以期為進一步保障受納水體的生態安全提供理論依據.

　　1 材料與方法1.1 實驗試劑

　　雌二醇 (E2) 以及鄰硝基酚β-D-半乳糖苷 (ONPG) 購自Sigma公司. SD培養基 (Synthetic dropout medium) 所需的硫酸腺嘌呤購于美國MP公司，葡萄糖購于阿拉丁.無氨基酵母氮堿、DO、SD/-Leu/-His所用的各種氨基酸購于Difco公司.二甲基亞砜 (DMSO)、HPLC級甲醇和乙酸乙酯購于天津科密歐公司. ELISA檢測試劑盒購于德國DRG (EIA-2693).

　　1.2 樣品采集和前處理

　　2015年8~10月分別對3個污水處理廠 (A、B、C) 各流程出水進行采集.水樣的采集及標號如下：A-1~A-6依次為以氧化溝工藝為主的A污水處理廠對應處理單元的出水，A-S為氧化溝污泥樣品;B-1~B-6依次為以A2/O工藝為主的B污水處理廠對應處理單元的出水，B-S為好氧污泥樣品;C-1~C-3依次為以A2/O+MBR為主的C污水處理廠主要處理單元的出水，C-S1和C-S2分別為好氧池污泥和MBR膜池污泥樣品.各污水廠處理流程及采樣點

　每個采樣點采集2 L水樣或1 L污泥混合液放入對應編號的棕色玻璃瓶中，并立即帶回實驗室.水樣經玻璃纖維膜 (0.7 μm, Millipore, GF/B) 過濾后用HLB柱子 (Oasis HLB 200 mg Cartridge, Waters) 富集.具體操作如下：依次用10 mL乙酸乙酯、10 mL甲醇和10 mL超純水活化HLB柱子.取調節pH為3的水樣2 000 mL以10 mL ·min-1的流速過柱，隨后用10 mL超純水-甲醇 (9:1) 洗柱，繼續真空干燥1 h.后用10 mL乙酸乙酯以1 mL ·min-1流速洗脫到10 mL的試管中，40℃水浴下用微氮氣吹干.萃取物用1 mL DMSO進行溶解，均分成兩份，一份用DMSO梯度稀釋用于雌激素活性檢測，另一份用超純水稀釋100倍用于ELISA (E2) 檢測.

　　污泥混合液經中速定性濾紙過濾后，收集濾紙上污泥，真空冷凍干燥2~3d.之后準確稱取1.0 g污泥并研磨成粉狀.將研磨好的污泥放入10 mL磨口俱塞試管中，進行超聲萃取4次，萃取劑分別為5 mL甲醇、5 mL甲醇、2×3 mL丙酮，每次萃取時間為15 min.每次萃取完，上清液經0.45 μm針頭式樣品PTFE過濾器過濾后用氮氣吹至500 μL，加入超純水，并用超純水多次洗滌定容至500 mL.固相萃取步驟同水樣.

　　1.3 重組酵母菌檢測

　　雌激素活性采用中科院生態環境中心建立的酵母雙雜交雌激素活性評價方法.每個樣品按梯度稀釋8個濃度 (濃縮液稀釋倍數：1、1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128).將酵母菌置于SD培養基中，在30℃、130 r ·min-1條件下培養36 h.用SD培養液稀釋菌液至其在600 nm的吸光度值為0.75左右，吸取菌液995 μL于1.5 mL滅菌離心管中，加入5 μL稀釋的樣品并混勻，每個濃度設置3個平行.將200 μL的混合菌液轉移到96孔板中，在30℃、800 r ·min-1條件下暴露4 h.測定菌懸液在600 nm的吸光度值，隨后每孔棄去150 μL，加入120 μL測試緩沖液和20 μ，于1 200 r ·min-1振蕩破壁15 min，加入40 μL ONPG，于30℃、800 r ·min-1下培養顯色60 min.顯色結束后，每孔加入100 μL碳酸鈉溶液，終止反應.吸取上清液200 μL至新96孔板中，測定420 nm處吸光度.同時，以DMSO做陰性對照，以E2為陽性對照.

式中，t為加入ONPG到溶液顯色時的反應時間，60 min;V為菌液體積，0.2 mL;A600、A420分別為菌液在600 nm、420 nm處的光密度值;A′420為空白對照在420 nm處的光密度值;D為稀釋因子6.6.

　　由劑量效應曲線得出β-半乳糖苷酶活性后，根據小二乘法如公式 (2) 計算水樣的EC50.

式中，y為β-半乳糖苷酶活性;X為水樣濃縮倍數;A為大β-半乳糖苷酶活性;B為回歸曲線中點的斜率;C為半數大β-半乳糖苷酶活性時水樣的濃縮倍數 (EC50);D為本底β-半乳糖苷酶活性.

　　對于樣品的雌二醇當量用EEQ表示，

1.4 酶聯免疫吸附檢測 (ELSIA-E2)

　　取25 μL標準品 (試劑盒中自帶的E2的標準溶液分別為0、25、100、250、500、1 000、2 000 ng ·L-1)、質控品 (實驗室自配的E2濃度：200 ng ·L-1) 和濃縮的樣品加入相應微孔中.在每一微孔中加入200 μL酶聯物，充分混勻10 s，室溫孵育120 min.快速棄去孔內反應物，每孔用400 μL洗滌液洗板3次，在吸水紙上拍干.每一微孔中加入100 μL底物液，室溫孵育15 min.加50 μL終止液到每個檢測孔中終止酶反應，在10 min之內測定450 nm的吸光度值.所有的標準品、質控品和樣品設置3個平行.按照以上步驟對E2標準溶液進行測定，并以每個濃度的吸光度的平均值作為此濃度的吸光度B.用公式 (4) 計算吸光率.以濃度對數lgc對吸光率對數lg (B/B0) 繪制標準曲線圖.

式中，A450為450 nm處的吸光度;空白為0 ng ·L-1的E2.

　　2 結果與討論2.1 污水中雌激素活性的分析

　　以DMSO為溶劑配置一系列E2標液，按上述方法測定β-半乳糖苷酶誘導活性值，得出E2的劑量-活性效應關系如圖 2所示.從中可以得出E2的EC50為6.73×10-11 mol ·L-1，與馬軍等[15]的研究結果 (5.95×10-11 mol ·L-1) 具有*性，說明了該方法的可行性.

各污水處理廠主要單元出水的雌激素活性如圖 3所示. A、B和C污水處理廠進水均表現出較強的雌激素活性，EEQ分別為7.58、7.29、4.35 ng ·L-1. C污水處理廠進水的EEQ低于其它兩個污水處理廠.產生這種現象的原因可能是污水來源不同，C污水處理廠污水來源是校園污水，污水成分簡單，而其余兩個污水處理廠污水來源則是城市污水，承接污水比較廣泛，雌激素活性較強. Shore等也指出污水來源影響污水廠進水的雌激素活性.經氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR工藝處理之后，出水的EEQ降低為2.19、1.89、1.06 ng ·L-1.孫慶峰等采用ER-CALUX方法將雌激素活性作為飲用水水質指標時，得出大無劑量效應的EEQ為0.4 ng ·L-1.因此，本研究中的3個污水廠出水仍具有很高的風險性.

曝氣沉砂池單元對雌激素活性的去除能力非常有限，去除率≤11%.這可能是由于曝氣沉砂池主要用于去除污水的無機顆粒物、油脂類以及少量的有機污染物等;另一方面，雌激素物質，如E1、E2、E3和EE2，具有較低的亨利常數，在常溫常壓下很難揮發，導致曝氣作用對雌激素活性的去除效果不佳.由圖 3(B)可以看出污水經初沉池處理之后，雌激素活性基本沒有變化.初沉池主要是通過重力沉降作用去除大顆粒物質，而污水的雌激素物質主要存在于液相，單純的物理沉降作用無法顯著降低污水的雌激素活性.

　　對比3個污水處理廠的主要工藝發現，雌激素活性的降低主要依賴污水處理的氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR工藝.經過這些工藝處理之后，EEQ分別降低71.10%、74.07%和75.54%.另外，3個污水處理廠出水的氨氮濃度均低于5 mg ·L-1，達到一級A排放標準，總磷的濃度低于1 mg ·L-1，達到一級B排放標準.這說明3個污水廠的生物處理單元具有良好的脫氮除磷效果和較好的菌落結構.而固醇類雌激素如E1、E2、E3和EE2主要是通過氨氧細菌共代謝作用和異養菌作用得到降解，當污水處理過程中具有良好的硝化作用時，這些物質可得到很好地去除.例如，Khunjar等指出氨氧化菌將EE2降解為某中間產物如羥基EE2，而異養菌可將EE2的中間產物繼續降解為更簡單的結構甚至碳化.同時，本實驗檢測到3個污水處理廠活性污泥的雌激素活性，如圖 4所示.氧化溝污泥、A2/O工藝好氧池污泥、A2/O+MBR工藝的好氧池污泥和MBR膜池污泥的EEQ分別為1.84、1.85、2.16、2.43 ng ·g-1.物質的lgkow值決定了其與污泥的吸附能力，當化合物的lgkow介于2.5~4.0時表現出中度的吸附能力;大于4.0時，表現出高的吸附能力.而水環境中主要的雌激素物質如E1、E2、E3和EE2的lgkow分別為3.43、3.94、2.81和4.15.因此，活性污泥可通過吸附作用去除部分的雌激素活性.

污水出水的雌激素活性基本沒有變化.這可能由于消毒過程產生的消毒副產物具有一定的雌激素活性，導致出水的EEQ比較恒定.一些研究指出E1、E2和EE2的消毒副產物，如2, 4二氯雌酮、2, 4二氯雌二醇以及4-氯乙炔雌二醇，具有和母體相當的雌激素活性.由圖 3(c)看出，經MBR處理之后，污水的EEQ降低了22.62%.膜生物反應是結合膜分離和生物處理方法的處理技術，能夠強化有機物的去除.

　　2.2 酶聯免疫吸附法 (ELISA) 檢測E2的濃度

　　以E2濃度對數lgc和吸光率對數lg (B/B0) 作標準曲線，線性回歸方程為：

該方程的相關系數為0.989.根據標準曲線得到各污水處理廠主要工藝出水的E2濃度，如圖 5所示.從中可知，A、B和C污水廠進水中E2濃度分別為64.83、83.43和36.95 ng ·L-1.以校園污水為來源的C污水處理廠進水的E2濃度低于其余兩個污水廠，該結果和雌激素活性具有*性. B污水處理廠經曝氣沉砂池和初沉池處理之后，E2的濃度并沒有明顯的降低. 3個污水廠進水分別經氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR工藝處理之后，污水廠出水E2的濃度分別為6.47、16.82、4.48 ng ·L-1.

生物處理階段對E2的去除起著主導作用.氧化溝工藝、A2/O工藝和A2/O+MBR對E2的去除率分別為75.88%、77.84和80.72%. B污水處理廠對E2的去除效果稍高于A污水廠，這可能是由于E2在厭氧、缺氧和好氧條件下均可以被微生物降解，而A2/O工藝具有延長生物處理作用的特點.另外，良好的硝化過程有利于雌激素的去除，A2/O工藝的脫氮除磷效果高于氧化溝工藝. C污水廠二級出水經MBR工藝處理后，E2的濃度降低37.16%，這可能是MBR單元具有良好的泥水分離效果，使污泥濃度增大，微生物活性增強，強化了有機物的去除.由圖 5可知，加氯消毒對E2的去除效果并不明顯.加氯消毒的效果與消毒劑量有關，而市政污水存在較多消毒副產物的前驅物如腐殖質、富里酸和腐殖酸等影響加氯消毒對E2的去除.此外，A、B和C污水處理廠活性污泥中E2含量分別為11.70、12.84、9.8和8.45 ng ·g-1，如圖 6所示.如前所述，E2具有一定的親脂性，容易被污泥吸附.雌激素物質被污泥吸附之后，通過污泥回流進一步實現脫附和降解，但終通過剩余污泥帶走的雌激素總量不超過進水的5%.因此，污泥對E2的去除效果是微弱的.

　2.3 重組酵母菌法和酶聯免疫法的比較

　　將用ELISA檢測的E2值與用酵母菌法檢測的EEQ相比，ELISA檢測的E2值偏低. Välitalo等研究也發現ELISA檢測的水體目標物濃度水平 (E2) 比ERα-CALUX®檢測的EEQ要高.環境水樣中存在和E2結構非常相似的其他雌激素，如E1、E3和EE2.這些物質可以與微孔板上包被的E2抗體發生交叉反應，從而使ELISA檢測結果偏高.另一方面，由于污水成分復雜，一些抗雌激素物質的存在以及物質之間存在拮抗作用，可導致檢測的雌激素活性相應較低.因此，兩種檢測結果具有一定的差異性.通過統計學對ELISA檢測的E2值和酵母菌檢測的EEQ進行分析，得出兩者具有很好的*性，如圖 7，相關系數為0.837.這表明兩指標在結果評價上整體趨勢的*，ELISA檢測技術為水環境雌激素的快速篩選和診斷提供了一個新方法.

3 結論

　　(1) 原污水的雌激素活性雌二醇當量為4.35~7.58 ng ·L-1，出水中雌二醇當量降至1.06~2.19 ng ·L-1，去除率為71.10%~75.54%.雌激素活性的去除主要發生在生物處理階段，如氧化溝和A2/O處理單元.

　　(2) 原污水的E2濃度為36.95~83.43 ng ·L-1，氧化溝、A2/O和A2/O+MBR處理單元對E2具有很好的去除效果，去除效能分別為75.88%、77.84和80.72%，MBR工藝能夠強化E2的去除.

　　(3) 污泥中雌二醇當量和E2的含量分別為1.84~2.43 ng ·g-1和8.45~12.84 ng ·g-1，污泥可通過吸附作用去除一定的雌激素活性和E2.

　　(4) 酶聯免疫法與酵母菌法具有很好的*性，并為水環境雌激素的快速篩選和診斷提供了一個新的方法.

WFRL-AO廣東省廣州市生活污水處理設備

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