標記蛋白抗體/葡聚糖制備方法及操作步驟

  一般每個抗體可以標記3-5個，標記時，與抗體的比率受抗體濃度影響，對于10 mg/ml 的抗體溶液來說，應過蛋白12倍（摩爾數），對于2 mg/ml 的抗體溶液應過20倍，也可以直接以粉末的形式加入蛋白溶液中。

    蛋白樣品不得含有疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物。

一、試劑和器材：

1、 標記反應溶液：0.1M  pH 7.2 PBS（0.15M sodium chloride）

NaCl 8.77 g ；Na₂HPO₄·12H₂O 32.3g ；NaH₂PO₄·2H₂O 4.5g；加雙蒸水 900mL 左右，用HCl/NaOH 調pH 7.2，后定容為 1000mL

2、 10mM NHS-dPEG4-Biotin配方：稱取0.56mg NHS-dPEG4-Biotin（分子量為587） ，溶解于95 µl 純水中，臨用前配置，不可儲存，立刻使用。NHS-PEG4-Biotin容易潮解，開瓶前平衡室溫。也可以配置200 nmol/L 儲備液：20mg NHS-dPEG4-Biotin 溶解于170µl DMSO中，-20℃穩定幾個月。

由于NHS-PEG4-Biotin昂貴，而且使用量少，不能保存，配制時，直接將NHS-PEG4-Biotin放入1.5ml EP管中，以實際稱量的NHS-PEG4-Biotin按比率加入純水。

3、濾管

⑴、Millipore濾管[0.5ml 10KD]:截留分子量10KD，殘留體積200µl，蛋白回收率95%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心10min。

⑵、Millipore濾管[0.5ml 50KD]:截留分子量50KD，殘留體積80µl，蛋白回收率94%，7500×g（允許的大離心力14000×g）離心5 min。

⑶、Amicon Ultra -0.5ml離心濾管（Millipore），，的終濃縮物體積：5-15ul。

二、抗體濾處理

標記前需要應用截留分子量為50kDa 的濾柱對抗體進行標記前純化處理(如果不是抗體，要按蛋白分子量來確定濾柱截留分子量)，以除去蛋白樣品中可能含有的疊氮鈉、BSA、甘氨酸、Tris或其他有自由氨基的添加物，干擾標記反應。

具體操作步驟：

1、 于濾柱中加入200μl 標記反應溶液，加入500ug 單克隆抗體，混勻。

2、 4℃，6000rpm，離心2min。棄濾液。

3、于濾柱中加入100μl 標記反應溶液，混勻。4℃，Max 14000×g，2min。

4、 重復步驟2 6到7次。

5、 混勻濾柱中的殘留的液體，室溫靜置1min。

6、 將濾柱反轉倒置于一新的濾管中，4℃，1000×g，2min，收集濾液。

7、 取50μl PBS于濾柱中混勻，靜置1min。

8、 倒置濾柱，4℃，6000rpm，2min。收集濾液，與步驟6的濾液合并，4℃放置備用。用標記反應溶液調節抗體濃度到2mg/ml （0.25ml）。

三、標記抗體

1、 計算抗體標記需要用量。 

    抗體濃度 2 mg/ml時的簡要計算：

1mL of 2 mg/mL IgG (150,000 MW)需要26 μL of  10mM  NHS-PEG4-Biotin

具體計算方式見附錄一（標記計算）

2、 濾后的濾液加入NHS-PEG4-Biotin溶液，室溫反應1h。

3、 葡聚糖凝膠分離純化(游離)：

四、葡聚糖凝膠分離純化標記抗體操作步驟：

   （一）、試劑：

 1、純化柱處理液 :100 mmol/L Na0H;

 2、純化柱平衡液: 50mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH7.4)，每升含0.5g NaN₃ ，8g NaCl;

3、樣品洗脫液:同純化柱平衡液;

4、標記抗體保護液（50×）: 10ml0.01M pH7.2 PBS 中加入0.5g BSA，0.2g NaN3。

（二）、凝膠過濾：

    方法見“凝膠過濾法純化微量標記蛋白”

五、標記抗體的保存方法

    將“標記抗體保護液（50×）”加入到標記抗體溶液中，使BSA終濃度為0.1%，4 ℃ 或-20 ℃ 保存。

六、數據記錄：

抗體濃度：    mg/ml        加入抗體體積：    µl

標記前抗體體積：   µl      加入NHS-PEG4-Biotin體積：    µl

純化柱規格：  cm ×   cm   凝膠體積：     ml

加入標記抗體體積：   µl        

洗脫溶液 1ml/管收集，到核酸蛋白檢測儀顯示出峰后，改為0.5ml/管收集，并記錄數據：

附錄：

一、標記計算：

   1、不同抗體濃度時，抗體與Sulfo-NHS-Biotin的比率：

     Sulfo-NHS-Biotin MW：589

2、10mmol/L Sulfo-NHS-Biotin 配方：

 3、標記計算加入體積計算：

西安齊岳生物可以提供的定制材料包括有：

dUTP-biotin

Biotin-Ubiquitin

修飾的納米銀探針

化的殼聚糖Bio-CS

星形七臂官能化聚己內酯(CDSPCABCL)

修飾的Pluronic普朗尼克

修飾二茂鐵Biotin-Fc

AP-tag標簽的FOXM1真核表達載體

Biotin-PEG-PLLA-PLL

聚乙二醇-聚乳酸-二丙烯酸酯(PPA)共聚物

Mpeg-b-PCL-b-PPEEA聚乙二醇-聚已內酯-聚（氨乙基乙撐磷酸酯）

PLGA-PPEEA 聚（氨乙基乙撐磷酸酯）-聚乳酸-羥基乙酸共聚物

PTMC-PEG-PTMC

修飾的冬凌草甲素脂質體

/雙配體修飾的殼聚糖材料

FA-CS-g-PSBMA -殼聚糖-磺酸甜菜堿

乳糖修飾殼聚糖

乳糖修飾去甲素(Lac-NCTD)

去甲素殼聚糖納米粒(NCTD-CS-NPs)

Biotin偶聯乳糖

半乳糖化殼聚糖接枝聚乙烯亞胺galactosylated chitosan-g-PEI

RGD多肽偶聯殼聚糖chitosan

半乳糖修飾的巰基化殼聚糖

甘草酸表面修飾殼聚糖GA-chitosan

甲氨喋呤-乳糖酰基殼聚糖MTX-殼聚糖

甲氨蝶呤化殼聚糖納米粒MTX-Biotin-CS

修飾β2微球蛋白

修飾稀土摻雜無機熒光納米顆粒

修飾螢火蟲熒光素酶

化微細纖維肽修飾IGF-1

修飾水溶性共軛聚合物(PFPNBr-biotin)

BDNF-PEG-biotin

化乙酰普魯蘭多糖

FAM-Biotin,FITC-Biotin綠色熒光標記

Biotin-NHS活化脂修飾

PHEMA-biotin 修飾聚(甲基丙烯酸-2-羥乙酯)

PLGA-Biotin 修飾PLGA

Biotin修飾紅細胞膜

poly(NIPAAm-co-Ada)

修飾的多肽RGD

Biotin修飾CdTe量子點

化修飾的聚己內酯(PCL/Biotin)

Biotin-PEG-b-Leu

鏈霉親和素化的量子點(streptavidin-QDs)

Prazosin-PEG2000-biotin

(Biotin)表面功能化修飾多壁碳納米管

Biotin-PEG-PLL-peptide-DOX

PLL-PEG-Biotin

Biotin-PEG-c(RGDyK)

biotin-HWTX-Ⅰ標記蛛素虎紋捕鳥蛛素-Ⅰ

ssDNA-Biotin-SA-AuNPs復合物

標記的透明質酸(HA-biotin

PAH-Biotin修飾半

Biotin-Ebselen小分子探針

偶聯四氨基卟啉

膽堿磷酰化偶聯殼聚糖

Chol-Dex-Biotin 偶聯葡聚糖修飾

DOTA-Biotin偶環配體造影

藻膽蛋白標記Phycobiliprotein-Biotin

藻膽蛋白-鏈霉親和素(Streptavidin-phycobiliprotein)

偶聯物OVA-ZEN-biotin

(Biotin)偶聯的多肽zs6

Biotin-DNA偶聯物

雞卵清白蛋白偶聯(Biotin-OVA)

輔酶A-(Coenzyme A-biotin)

FITC標記的轉鐵蛋白(Tf-FITC)

(biotin)修飾的ddNTP核苷酸

活化的轉鐵蛋白(Biotin-Tf)

HEMA-biotin-Lys-CD

蛤蚌素-偶聯物

姜黃素-偶聯物

多肽CRGD修飾紅細胞膜

偶聯膽甾醇化乙二醇殼聚糖

-葡聚糖聚醛偶聯物(Chol-Dex-CHO)

BIO修飾阿霉素DOX-biotin

修飾科研BIOTIN-Drud

CY3/CY5/CY5.5-Biotin修飾熒光染料

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