兔子Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)ELISA試劑盒說明書

l  本試劑盒用于體外定量檢測血清、血漿、組織、細胞上清及相關(guān)液體樣本中兔子Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)的含量。

l  有效期：6個月

l  保存條件：2-8℃

兔子Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)ELISA試劑盒實驗原理

試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）。  往預(yù)先包被兔子Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。    顏色的深淺和樣品中的兔子Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度。

兔子Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)ELISA試劑盒樣本處理及要求

1.  血清：全血標(biāo)本請于室溫放置2小時或4℃過夜后于1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
2.  血漿：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8°C 1000g離心20分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
3.  細胞培養(yǎng)物上清或其它生物標(biāo)本：1000g離心20分鐘，取上清即可檢測，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
注：標(biāo)本溶血會影響zui后檢測結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進行此項檢測。

需要而未提供的試劑和器材

1.     酶標(biāo)儀（450nm）

2.     高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL

3.     37℃恒溫箱

4.     蒸餾水或去離子水

兔子Ⅲ型前膠原(HPCⅢ)ELISA試劑盒問題解析：

1.試劑的選擇：選擇優(yōu)良試劑大家都是知道的，但是在檢測之前還應(yīng)該提前半個小時將試劑拿到常溫下進行解凍。

2.加樣中可能遇到的問題：在做血清或是血漿用于檢測試劑的時候，會碰到血清血漿不好分離的情況，這個時候的解決辦法是先放在常溫中1到2小時，然后在進行離心處理

3.洗板時容易造成誤差： 因為洗板是人工洗的，所以判斷什么時候洗干凈了也是人為判斷的，這個時候帶有主觀色彩，所以多清洗幾次，還有就是在洗的時候孔與孔之間的液體容易交叉流動

4.顯色問題： 使用了過期的顯色劑或者是顯色劑用過后放置時間太長，都有可能造成顯色劑不顯色。所以在進行顯色反應(yīng)的時候，要先查看顯色劑本身的情況

5.終止反應(yīng)：在加終止劑的時候由于傾倒速度快，差生氣泡，造成假陽性結(jié)果。所以在倒終止劑的時候要緩慢倒

6.讀板：讀板的時候首先應(yīng)該保證板的清潔干凈

試劑準備

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡后方可使用。

20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水。

操作步驟

1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。

2.  設(shè)置標(biāo)準品孔和樣本孔，標(biāo)準品孔各加不同濃度的標(biāo)準品50μL；

3.  樣本孔中加入待測樣本50μL；空白孔不加。

4.  除空白孔外，標(biāo)準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。

5.  棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液（350μL），靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機洗板）。

6.  每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。

實驗結(jié)果計算

以所測標(biāo)準品的OD值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準品的濃度值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上或用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準曲線，并得到直線回歸方程，將樣品的OD值代入方程，計算出樣品的濃度。

試劑盒性能

1.  檢測范圍：3.75 ng/mL – 120 ng/mL。

2.  靈敏度：zui低檢測濃度小于0.1 ng/mL。

3.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4.  重復(fù)性：板內(nèi)變異系數(shù)小于10% ，板間變異系數(shù)小于15% 。

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