A549+Luc人肺癌細胞+Luc
平臺編號:zl-000930
規格:1×10?cells/T25培養瓶
拉丁屬名:熒光標記細胞
細胞介紹
該細胞系由D.J.Griad通過肺癌組織移植培養建系，患者為58歲白人男性。A549能通過胞苷二磷酸膽jian途徑合成含有高含量不飽和脂肪酸的卵磷zhi。
該細胞通過慢病毒轉染的方式攜帶Luc基因。
細胞特性
1）來源：肺癌
2）形態：上皮細胞樣，多角形；貼壁生長
3）含量：>1x106細胞數
4）規格：T25瓶或者1mL凍存管包裝
5）用途：僅供科研使用
細胞篩選
該細胞為穩定轉染Luc的細胞，隨細胞傳代次數的增加，其Luc熒光強度會逐漸減弱。若實驗要求需要維持熒光強度，可以加入嘌呤霉素進行再次篩選。
建議收到細胞后至少傳3代，凍存留種后再進行篩選。
初次進行細胞篩選時，建議加入終濃度為1ug/ml嘌呤霉素的完quan培養基維持培養，若無細胞漂浮或者漂浮較少，即可更換為含2ug/ml嘌呤霉素的完quan培養基繼續篩選，以此類推，至最gao藥物濃度為5ug/ml。若篩選過程中，漂浮細胞大于60%，則停止篩選，換成正常培養基培養，至細胞密度約80%，可繼續加入同濃度嘌呤霉素進行篩選。當加入5ug/ml嘌呤霉素時細胞正常增殖，可停止篩選，用不含藥完quan培養基正常培養。
細胞誘導構建實驗步驟：
1.轉染（1）將A549細胞接種6孔板，每孔細胞數約為1×105個，
（2）第二天，細胞融合度為50%左右時用于病毒轉染，
（3）加入1mL完quan培養基，再加20μL Luciferase過表達慢病毒，
（4）混勻后繼續培養，
（5）12h后觀察細胞狀態，并更換為新鮮培養基，
（6）當細胞長滿板底后，傳代至T25培養瓶中。
2.篩選：用嘌呤霉素4ug/mL抗性篩選6周，穩轉細胞記作A549+Luc。
3.體外熒光素酶活性檢測
取A549細胞消化，離心，棄上清，加20μL細胞裂解液，再加100μL熒光素酶底物，檢測發光情況。
發光值
陰性
105
實驗組
18995
結果表明慢病毒感染A549細胞能穩定表達熒光素酶。
運輸和保存
干冰運輸及復蘇好存活細胞
（1）1mL凍存管包裝干冰運輸，收到后-80度冰箱保存過夜后轉入液氮或直接復蘇，若發現干冰已揮發干凈、凍存管瓶蓋脫落、破損及細胞有污染，請立即與我們聯系。
（2）T25瓶復蘇的存活細胞常溫發貨，收到后按照細胞接收后的處理方法操作。
細胞接收后的處理
1）收到細胞后，75%酒精消毒瓶壁將T25瓶置于37℃培養箱放置約2-3h，若發現培養瓶破損、有液溢出及細胞有污染，請拍照后及時聯系我們。
2）請在4或5X顯微鏡下確認細胞狀態，同時給剛收到的細胞拍照（10×，20×）各2-3張以及培養瓶外觀照片一張留存，作為售后時收到時細胞狀態的依據。
3）貼壁細胞：細胞在37℃培養箱中放置2-3h，顯微鏡下觀察細胞的生長和貼壁情況，有些貼壁細胞在快遞運送過程中會因振動脫落和脫落后成團的情況。若鏡下觀察細胞的生長密度若在60%以下，可去除培養瓶中灌液培養基（若有未貼壁的細胞需要離心回收，重懸打入到原培養瓶中）,加入新配制的完quan培養基6-8mL，放到細胞培養箱中繼續培養。若細胞生長密度達70%-80%以上，可以對細胞進行傳代處理。傳代過程中，若因運輸振動脫落的細胞需要離心回收。
4）備注：運輸用的培養基（灌液培養基）不能再用來培養細胞，請換用按照說明書細胞培養條件新配制的完quan培養基來培養細胞。收到細胞后第yi次傳代建議T25培養瓶1：2傳代。
一．細胞培養準備培養基及培養凍存條件準備：
1）準備F-12K培養基；優質胎牛血清，10%；雙抗，1%。
2）培養條件：氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。溫度：37℃，培養箱濕度為70%-80%。
3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現用現配。
二．細胞處理：
1）凍存細胞的復蘇：
將含有1mL細胞懸液的凍存管在37℃水浴中迅速搖晃解凍，加入到含4-6mL完quan培養基的離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，完quan培養基重懸細胞。然后將細胞懸液加入含6-8ml完quan培養基的培養瓶（或皿）中37℃培養過夜。第二天顯微鏡下觀察細胞生長情況和細胞密度。
2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養。
對于貼壁細胞傳代可以參考以下方法：
1.棄去培養上清，用不含鈣、鎂離子的PBS潤洗細胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白mei-0.53 mM EDTA于培養瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培養箱中消化1-2分鐘（難消化的細胞可以適當延長消化時間），然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養瓶后加入3-4ml含10%FBS的培養基來終止消化。
3.輕輕打勻后吸出，在1000RPM條件下離心3-5min，棄去上清液，補加1-2mL培養液后吹勻。將細胞懸液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照說明書要求配置的新的完quna培養基以保持細胞的生長活力，后續傳代根據實際情況按1:2~1:5的比例進行。
3）細胞凍存:收到細胞后建議在培養前3代時凍存一批細胞種子以備后續實驗使用。
下面T25瓶為例；
1.細胞凍存時按照細胞傳代的過程收集消化好的細胞到離心管中，可使用血球計數板計數，來決定細胞的凍存密度。一般細胞的推薦凍存密度為1×106~1×107個活細胞/ml.
2.1000rpm離心3-5min，去掉上清。用配制好的細胞凍存液重懸細胞，按每1ml凍存液含1×106~1×107個活細胞/ml分配到一個凍存管中將細胞分配到凍存管中，標注好名稱、代數、日期等信息。
3.將要凍存的細胞置于程序降溫盒中，-80度冰箱中過夜，之后轉入液氮容器中儲存。同時記錄好凍存管在液氮容器中的位置以便后續查閱和使用。
