DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）使用說明書
【產品名稱】
通用名稱：DNA恒溫快速擴增試劑盒（膠體金試紙條型）
【包裝規格】
貨號：WLN8203KIT
規格：48份/盒
【原理概述】
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下，重組酶和引物形成蛋白/單鏈核苷酸的復合體Rec/ssDNA，在輔助蛋白和單鏈結合蛋白SSB的幫助下，侵入雙鏈DNA模板；在侵入位點形成D-loop區域，并開始對DNA雙鏈進行掃描；待找到與引物互補的目的區域后，復合體Rec/ssDNA解體的同時，聚合酶也結合到引物的3’末端，開始鏈的延伸。依賴nfo酶的作用，加入根據模板設計的特異的分子探針，使用膠體金技術（三明治夾心法）可以對最終結果進行檢測。
【產品特點】
本試劑盒具有靈敏度高、特異性強、反應時間短（僅需12 min）等優點，反應組分為干粉狀態，操作簡便，易于保存。
本試劑對設備要求低，金屬浴、水浴鍋等即可進行反應操作，無需購買PCR擴增儀等價格高昂的專屬設備。
【引物設計】
建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；下游引物的5’端標記一個修飾基團。
引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。
【熒光探針設計】
在上下游引物中間，設計一段長度為46-52nt與目的片段互補的序列；5’端修飾一個抗原標記（典型FAM）;在5’端和3’末端的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為nfo的識別位點；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer等。
【試劑盒組成】
組成 | 含量 |
A buffer | 1.6 mL×1管 |
B buffer | 150 μL×1管 |
試劑 | 48份 |
使用說明書 | 1份 |
【試劑盒儲存】
1．運輸溫度：≤ 20 oC的恒溫環境；
2．儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 °C（± 5 °C）恒溫環境，避光保存，避免重壓、反復凍融；
3．產品有效期：14個月；
4．生產日期見外包裝。
【操作步驟】
提前30分鐘將試劑盒所需組分取出，室溫融化，震蕩混勻。
(1) 每個干粉反應管加入29.4 μL A buffer（注意：A buffer需融化混勻，否則會對實驗效果產生影響）；
(2) 每個反應管分別加入2 μL上游引物、 2 μL下游引物和0.6 μL探針（引物和探針濃度為10 μM，對于多個反應、步驟1和步驟2可以混合后再分裝至反應管中）；
(3) 向反應管中依次加入2 μL ~ 13.5 μL核酸模板（可根據實際需求調整加入模板的體積，并相應調整加入的ddH2O體積，至模板與ddH2O總體積為13.5 μL）；
(4) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務必上下顛倒甩動反應管8-10次進行混勻；對于多個反應，建議將B buffer加至反應管的蓋子內側上下顛倒后混勻）；
(5) 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入恒溫設備中37-39 oC孵育8-12 min；
(6) 反應結束后，取10 μL加入含有190 μL ddH2O的離心管中，混合均勻后，將膠體金試紙條的樣品端插入離心管中平衡，5 min內觀察質控線與檢測線判讀結果。
體系配制
組分 | 體積（μL） |
A buffer | 29.4 |
上游引物(10 μM) | 2 |
下游引物(10 μM) | 2 |
探針(10 μM) | 0.6 |
ddH2O和核酸模板 | 13.5 |
B buffer | 2.5 |
總體積 | 50 |
【注意事項】
1．由于試劑盒靈敏度非常高，在進行反應時請注意避免核酸污染，并設置空白對照；
2．使用時請取出實驗所需的MIRA反應單元的數量，剩余部分請置于存儲條件下。
