RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型）使用說明書
【產品名稱】
通用名稱：RNA恒溫快速擴增試劑盒（液體熒光型）
【包裝規格】
貨號：WLRE5003
規格：100T
【原理概述】
本試劑盒基于一種常溫恒溫核酸快速擴增技術：在常溫恒溫下，特殊修飾的反轉錄酶利用特異性引物DNA和模板RNA合成cDNA鏈，反應體系中的重組酶、單鏈DNA結合蛋白和DNA聚合酶以新合成的cDNA鏈為模板進行快速核酸擴增反應。本試劑盒在42 oC下，依賴核酸外切酶的作用，加入根據模版設計的特異的分子探針，使用熒光監測設備能實現對目標片段擴增過程的實時監控。適用于實驗室級別的RNA擴增以及其他檢測用途的RNA擴增使用。
【引物設計】
建議使用長度在30-35 bp的引物，引物過短會影響擴增速度和檢測靈敏度；引物設計避免形成二級結構而影響擴增；擴增子長度建議在150-300 bp，通常不超過500 bp。
【熒光探針設計】
探針序列不與特異性引物識別位點重疊，長度為46-52 nt，序列避免回文序列、內部二級結構和連續的重復堿基。探針共有四個修飾位點：距離5’端的≥ 35 nt的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF），作為核酸外切酶的識別位點；THF位點的上游標記一個熒光基團，下游標記一個粹滅基團，兩個基團的間距為2-4 nt；THF距離3’末端≥15 nt，并且3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團或C3-Spacer。
【試劑盒組成】
組成 | 含量 |
C buffer | 1 mL×2管 |
L buffer | 500 μL×1管 |
PR-core | 1.2 mL×1管 |
E-core | 60 μL×1管 |
B buffer | 300 μL×1管 |
使用說明書 | 1份 |
【試劑盒儲存】
1．運輸溫度：≤ 20 oC的恒溫環境；
2．儲存條件：儲存溫度 ≤ -20 °C的恒溫環境，避光保存，避免重壓、反復凍融；
3．產品有效期：6個月；
4．生產日期見外包裝。
【操作步驟】
提前將試劑盒所需組分取出，冰上或低溫下融化（C buffer可室溫融化），震蕩混勻。
(1) 向無菌0.2mL PCR管中加入20 μL C buffer、5 μL L buffer；
(2) 加入2 μL上游引物、2 μL下游引物和0.6 μL探針，
(3) 加入1.5μL dNTPs(10 mM)；
(4) 加入12 μL PR-core和0.6 μL E-core（步驟1~4可以混合后再分裝至反應管中）；
(5) 向反應管中加入3.8 μL核酸模板；
(6) 最后向反應管中加入2.5 μL B buffer并充分混合（請務必上下顛倒甩動反應管8-10次進行混勻；對于多個反應，建議提前將B buffer加至反應管的蓋子內側，蓋上蓋后上下顛倒后混勻）；
(7) 混勻后，將反應液甩（或快速離心）至管子底部，然后立即將反應管放入熒光檢測設備中。熒光檢測程序設置為：恒溫42 oC；每30 s采集一次熒光信號；反應時間20 mins。
注：如使用ABI系列PCR儀，請務必于passive reference和quencher處均選擇“none"。
體系配制
組分 | 體積（μL） |
C buffer | 20 |
L buffer | 5 |
PR-core | 12 |
E-core | 0.6 |
dNTPs(10 mM) | 1.5 |
下游引物(10 μM) | 2 |
下游引物(10 μM) | 2 |
探針(10 μM) | 0.6 |
核酸模板 | 3.8 |
B buffer | 2.5 |
總體積 | 50 |
【注意事項】
1. 由為保證液體試劑組分活性，請保證儲存溫度 ≤ -20 oC；試劑使用時請保持低溫，避免高溫放置過長時間；
2. 在進行反應時請注意避免微量核酸染，并設置空白對照實驗組。
