熒光抗體的制備標(biāo)記
用于標(biāo)記的抗體，要求是高特異性和高親和力的。所用抗血清中不應(yīng)含有針對(duì)標(biāo)本中正常組織的抗體。一般需經(jīng)純化提取IgG后再作標(biāo)記。
作為標(biāo)記的熒光素應(yīng)符合以下要求：
①應(yīng)具有能與蛋白質(zhì)分子形成共價(jià)鍵的化學(xué)基團(tuán)，與蛋白質(zhì)結(jié)合后不易解離，而未結(jié)合的色素及其降解產(chǎn)物易于清除。
②熒光效率高，與蛋白質(zhì)結(jié)合后，仍能保持較高的熒光效率。
③熒光色澤與背景組織的色澤對(duì)比鮮明。
④與蛋白質(zhì)結(jié)合后不影響蛋白質(zhì)原有的生化與免疫性質(zhì)。
⑤標(biāo)記方法簡(jiǎn)單、安全無毒。
⑥與蛋白質(zhì)的結(jié)合物穩(wěn)定，易于保存。
常用的標(biāo)記蛋白質(zhì)的方法有攪拌法和透析法兩種。以FITC（異硫氰酸熒光素）標(biāo)記為例，攪拌標(biāo)記法為：先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液用0.5ml／L pH9.0的碳酸鹽緩沖液平衡，隨后在磁力攪拌下逐滴加入FITC溶液，在室溫持續(xù)攪拌4～6h后，離心，上清即為標(biāo)記物。此法適用于標(biāo)記體積較大，蛋白含量較高的抗體溶液。優(yōu)點(diǎn)是標(biāo)記時(shí)間短，熒光素用量少。但本法的影響因素多，若操作不當(dāng)會(huì)引起較強(qiáng)的非特異性熒光染色。
透析法適用于標(biāo)記樣品量少，蛋白含量低的抗體溶液。此法標(biāo)記比較均勻，非特異染色也較低。方法為：先將待標(biāo)記的蛋白質(zhì)溶液裝入透析袋中，置于含F(xiàn)ITC （異硫氰酸熒光素）的0.01mol／L pH9.4碳酸鹽緩沖液中反應(yīng)過夜，以后再對(duì)PBS透析法去除游離色素。低速離心，取上清。
標(biāo)記完成后，還應(yīng)對(duì)標(biāo)記抗體進(jìn)一步純化以去除未結(jié)合的游離熒光素和過多結(jié)合熒光素的抗體。純化方法可采用透析法或?qū)游龇蛛x法。
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