人類基因組計(jì)劃與美國(guó)塞萊拉遺傳信息公司于 2001 年在美國(guó)《科學(xué)》雜志和英國(guó)《自然》雜志聯(lián)合宣布，他們繪制出了準(zhǔn)確、清晰、完整的人類基因組圖譜，至此，人類基因組計(jì)劃已基本完成，隨著后基因組時(shí)代的到來，蛋白質(zhì)組學(xué)得到了的發(fā)展，蛋白質(zhì)組研究旨在揭示基因表達(dá)的真正執(zhí)行生命活動(dòng)的全部蛋白質(zhì)的表達(dá)規(guī)律和生物功能。包括蛋白質(zhì)組、蛋白質(zhì)組學(xué)、功能蛋白質(zhì)組學(xué)和結(jié)構(gòu)基因組學(xué)等新的概念的提出，蛋白質(zhì)組學(xué)已成為當(dāng)今生物領(lǐng)域中極其活躍的學(xué)科。其中雙向電泳 （Two Dimensional Electrophoresis ， 2DE） 是蛋白質(zhì)組研究的三大關(guān)鍵核心技術(shù)之一 （ 另兩種是質(zhì)譜技術(shù)和蛋白質(zhì)組信息學(xué) ） 。由于雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它可用于蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后修飾研究，蛋白質(zhì)組的比較和蛋白質(zhì)間的相互作用，細(xì)胞分化凋亡研究，致病機(jī)制及耐藥機(jī)制的研究，療效監(jiān)測(cè)，新藥開發(fā)，癌癥研究，蛋白純度檢查，小量蛋白純化，新替代疫苗的研制等許多方面。

　　雙向電泳由于具有高分辨率和高靈敏度已成為分析復(fù)雜蛋白混合物的基本工具。自 1975 年， O ' Farrel 等建立這種技術(shù)后，已有許多改進(jìn)，使得這一技術(shù)日趨完善， 2DE 的*向電泳是等電聚焦電泳 （Iso-Electric Focusing ， IEF） ，然后通過十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳 （SDS-PAGE） 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行第二向電泳；在 IEF 中，蛋白質(zhì)因等電點(diǎn)不同而被分離，在 SDS-PAGE 中，不同分子量的蛋白質(zhì)相互間被分離開，再用考馬斯亮蘭或銀染進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng) Pdquest 等軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行比對(duì)、解析。由于蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和分子量是兩個(gè)彼此不相關(guān)的重要性質(zhì)，而 2DE 同時(shí)利用了蛋白質(zhì)間的這兩個(gè)性質(zhì)上的差異分離蛋白質(zhì)，因此 2DE 的分離能力非常強(qiáng)大，它甚至能將細(xì)胞中的 5000 種蛋白分離開， 2DE 在分離蛋白混合樣品，比較差異方面有不可替代的作用，結(jié)合質(zhì)譜鑒定技術(shù)可查明大型蛋白復(fù)合物各組組分，與其它生物技術(shù)如分子生物學(xué)、分子遺傳工程、免疫學(xué)、微量蛋白質(zhì)的自動(dòng)氨基酸序列分析相結(jié)合，可以快速準(zhǔn)確地發(fā)現(xiàn)和鑒定新的蛋白質(zhì)

1. 雙向電泳技術(shù)應(yīng)用過程中的關(guān)鍵步驟

a. 樣品制備 （ 蛋白提取 ）

（1） 細(xì)胞培養(yǎng)、處理和收集；

（2） 將細(xì)胞在 IEF 裂解緩沖液中溶解；

（3） 將樣品離心以去除不溶的細(xì)胞碎片和 DNA ，提取上清， -80 ℃保存。

b. 蛋白質(zhì)定量和上樣

（1） 固相 PH 梯度干膠條 （Immobi-line PH Gradient ， IPG） 水化、等電聚焦；

（2）IPG 的平衡；

（3）SDS-PAGE ；

（4） 蛋白質(zhì)檢測(cè)：考馬斯亮蘭染色或銀染色。

c. 圖像分析及數(shù)據(jù)處理

　　將染色后的凝膠放在 GS-710 光密度掃描儀上，掃描后的圖像用 PDQUEST 2D 軟件分析，選擇部分匹配的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)進(jìn)行比較。

2. IPG 的優(yōu)點(diǎn)

a.PH 梯度穩(wěn)定、聚焦準(zhǔn)確、精度高；

b. 無陰極漂移、堿性蛋白丟失的現(xiàn)象；

c. 蛋白上樣量大，可提高低含量成分的分辨效果；

d. 樣品中的鹽的干擾少，無邊緣效應(yīng)；

e.PH 梯度、分離結(jié)果重現(xiàn)性好。

3. 在雙向電泳應(yīng)用中所面臨的問題

　　許多疏水性蛋白質(zhì) （ 如膜蛋白 ） 不溶于樣品緩沖液，分子量過大 （>200kD （ 千道爾頓 ）） 酸性或堿性蛋白在電泳過程中易丟失， 2DE 不能分辨。低含量組分易被高含量組分遮蔽，降低分辨率。蛋白在提取和消化過程中的丟失、凝膠的污染、在不影響分辨率情況下的上樣量等等。

4. 雙向電泳在醫(yī)學(xué)研究中的應(yīng)用

a. 人類疾病的蛋白質(zhì)組研究

（1） 直腸癌：直腸癌的發(fā)生是一個(gè)多基因突變導(dǎo)致抑癌基因失活，癌基因活化的過程。 Sanchez 等對(duì) 15 例結(jié)腸癌和 13 例正常人的結(jié)腸上皮進(jìn)行 2DE ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在分子量為 13kD 和 PI（ 增殖指數(shù) ） 值為 5.6 處的蛋白質(zhì)僅出現(xiàn)在結(jié)腸癌的組織中。其中 15 例患者的癌細(xì)胞中有 13 例 13kD/PI5.6 蛋白有上調(diào)趨勢(shì) （87%） 。此外，發(fā)現(xiàn)此種蛋白不僅在中度、低度分化的結(jié)腸癌及有 24 年病史的潰瘍性結(jié)腸炎過度表達(dá)，而且出現(xiàn)在 7 例分化程度不同的腺瘤的癌前病灶，但對(duì)照組則很少出現(xiàn)，這表明該蛋白的出現(xiàn)對(duì)檢測(cè)早期直腸癌有重要的臨床意義。

（2） 肝癌： Peter 等在用 N- 甲基 -N- 亞硝基脲誘導(dǎo)的小鼠肝癌中，用 2DE 及氨基酸微型測(cè)序可分辨出肝癌誘導(dǎo)的醛糖還原酶樣的蛋白質(zhì) （35kD/PI7.4） ，此種蛋白質(zhì)在肝癌、胎肝中有高表達(dá)。經(jīng)免疫組化證實(shí)，肝癌誘導(dǎo)的醛糖還原酶樣的蛋白質(zhì)在成人肝臟中不表達(dá)，但在小鼠的肝癌中又重新表達(dá)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)該蛋白在癌前病變及肝癌中表達(dá)強(qiáng)烈，而在肝臟周圍的正常組織不表達(dá)，表明該蛋白可能與肝癌的發(fā)病有很大關(guān)系。

（3） 膀胱癌：丹麥的一個(gè)小組利用 2DE ，并結(jié)合了蛋白印跡法、微型序列分析及質(zhì)譜技術(shù)分析了 150 例膀胱癌病人的組織，發(fā)現(xiàn)角蛋白 10 、 14 及銀屑病相關(guān)的脂肪酸結(jié)合蛋白等可作為膀胱癌不同分化程度的標(biāo)記物。

（4） 腎癌： Sarto 在對(duì)腎癌的研究中發(fā)現(xiàn)有 4 種蛋白質(zhì)存在于正常腎組織而在腎癌細(xì)胞中缺失，其中兩種分別是輔酶 Q 蛋白色素還原酶和線粒體泛醌氧化—還原復(fù)合物 I ，這提示線粒體功能低下可能在腫瘤發(fā)生過程中起重要作用。

（5） 擴(kuò)張型心肌病：擴(kuò)張型心肌是一種嚴(yán)重的可導(dǎo)致心衰的心臟病，其發(fā)病機(jī)理尚不明確，推測(cè)可能為多種因素所致， Knecht 等采用 2DE 取得了 3300 個(gè)心肌蛋白條帶，通過氨基酸序列分析， Edman 降解法及基質(zhì)輔助的激光解吸離子化質(zhì)譜 （MALDI-MS） 等分析了其中 150 條，經(jīng)活檢及病理證實(shí)，有 12 條為擴(kuò)張型心肌病*的蛋白。

（6）RA 和 OA ：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎 （RA） 是一種常見的慢性炎性關(guān)節(jié)疾病，本病侵犯多個(gè)關(guān)節(jié)，主要累及手足小關(guān)節(jié)，病情遷延反復(fù)，主要的病理變化為關(guān)節(jié)滑膜的慢性炎癥，細(xì)胞侵潤(rùn)，血管翳形成，軟骨及骨組織侵蝕，導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)的破壞，功能喪失。而骨性關(guān)節(jié)炎 （OA） 其基本病理改變?yōu)槎喾N致病因素引起的進(jìn)行性關(guān)節(jié)軟骨變性，破壞及喪失，關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨邊緣骨贅形成，由此引起一系列的關(guān)節(jié)癥狀和體征。有研究者對(duì)滑膜細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng)，應(yīng)用流式細(xì)胞儀鑒定滑膜細(xì)胞類型，提取蛋白進(jìn)行雙向電泳分離，比較 RA 與 OA 成纖維樣滑膜細(xì)胞 （Fibroblast-Like Syno-viocytes ， FLS） 蛋白酪氨酸磷酸化狀態(tài)的差異，結(jié)果顯示： RAFLS 蛋白酪氨酸磷酸化較 OAFLS 明顯增多，其中以相對(duì)分子質(zhì)量 42 × 10 3 ~95 × 10 3 間蛋白酪氨酸磷酸化位點(diǎn)居多，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行灰度掃描， RAFLS 灰度掃描值為 4227672 ± 8947 ， OAFLS 為 663480 ± 7962 ， RAFLS 的灰度掃描值約為 OAFLS 的 6.5 倍，兩者具有非常顯著性差異 （T= 2.820 ， P<0.01） 。 1980 年 Hunter 首先發(fā)現(xiàn)酪氨酸激酶 （PTK） ，許多生長(zhǎng)因子受體都具有 PTK 活性，一半以上的癌基因產(chǎn)物也具有 PTK 活性，他發(fā)現(xiàn)酪氨酸磷酸化比例雖小，但卻與細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖關(guān)系密切，很可能是正常細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞相互轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵，癌基因活化后， PTK 活性大大增加。 1992 年， Williams 等研究發(fā)現(xiàn)， RA 滑膜細(xì)胞中的 PTK 活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 OA ，這可能是導(dǎo)致 RA 滑膜細(xì)胞轉(zhuǎn)化特性而呈持續(xù)活化狀態(tài)的關(guān)鍵，作者推測(cè) RAFLS 可能存在原癌基因的活化或突變，或多種生長(zhǎng)因子受體的持續(xù)激活，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)化細(xì)胞的外觀表現(xiàn)并伴有 PTK 活性的增高。

（7） 其它：目前許多研究者利用 2DE 對(duì)人體的各種組織、器官、細(xì)胞進(jìn)行了研究，為疾病的診治及了解發(fā)病機(jī)制提供了新的手段。如 Bobring 等聯(lián)合雙向電泳與 Western 技術(shù)鑒定分離了高純度精子膜蛋白，發(fā)現(xiàn) 14 種膜抗原。它們極有可能與男性不孕癥或輸精管切除患者體內(nèi)抗精子自身抗體 SPAb 結(jié)合，影響精子運(yùn)動(dòng)與頂體反應(yīng)，為深入了解精子不育機(jī)理，確定 SPAb 的存在找到一個(gè)可行的方法。有作者在酒精對(duì)人體毒性的研究中發(fā)現(xiàn)，乙醇會(huì)改變血清蛋白糖基化作用，導(dǎo)致許多蛋白的糖基缺乏，如轉(zhuǎn)鐵蛋白。

b. 致病微生物的蛋白質(zhì)組研究

（1） 檢測(cè)博氏疏螺旋體與免疫相關(guān)的蛋白質(zhì)：博氏疏螺旋體是萊姆病的主要原因，約有 50% 的未治患者發(fā)展為神經(jīng)系統(tǒng)及關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病，該螺旋體分為三種類型： B.burgdorferi sensu stricto ； B.garinii ； B.afzelii 。其診斷由于血清學(xué)檢查的局限性而存在敏感性及特異性變化大的缺點(diǎn)，為克服這一不足， Peter 等用 2DE 從 B.garinii 得到 217 個(gè)銀染的蛋白斑點(diǎn)，從中用兔多克隆抗體鑒別出 6 個(gè)已知抗原，將不同臨床表現(xiàn)萊姆病患者的血漿用 B.garinii 2DE 圖雜交。用抗 IgM 及抗 IgG 作為第二抗體，在 10 例有游走性紅斑的患者血漿中，檢測(cè)出 60~80 個(gè)抗原，同時(shí)發(fā)現(xiàn)在有關(guān)節(jié)炎患者血漿中，包含有抗 15 種抗原的 IgM 抗體及抗 76 種不同抗原的 IgG 抗體。而晚期有神經(jīng)系統(tǒng)癥狀的患者血漿中，則包含有抗 33 種抗原的 IgM 抗體及抗 76 種抗原的 IgG 抗體。上述三種類型患者的血漿中均包含有抗 6 種已知抗原的抗體，且被 SDS-PAGE 雜交所證實(shí)，這些抗原均為特異性診斷的標(biāo)志物。

（2） 弓形體抗原的檢測(cè)：弓形體病是由鼠弓形體蟲引起的寄生蟲病，如果懷孕的婦女在妊娠期受到感染，該蟲可通過胎盤引起胎兒的感染，大約 50% 新生兒由于母體的感染而引起先天性疾病。目前一般利用血清學(xué)及 PCR ，而單獨(dú)采用血清學(xué)如用 IgG 、 IgM 或 IgA 抗體對(duì)疾病活動(dòng)期敏感性不夠，尤其對(duì)于妊娠或有免疫抑制的患者，因此臨床上能否作到早期診斷，而使患者得到早期治療尤為重要。 Jungblut 等將鼠弓形體蟲 RH 株在人羊膜細(xì)胞系 FL521 中傳達(dá)后，用 2DE 得到 300 個(gè)銀染斑點(diǎn)，再將其與以下三種患者的血漿進(jìn)行免疫雜交：

（a） 患有急性弓形體病的妊娠婦女 （N=11） ；

（b） 患急性弓形體病的非妊娠 （N= 6） ；

（c） 有潛在感染的患者 （N=9） 。

　　結(jié)果有 9 個(gè)斑點(diǎn)對(duì)各階段的弓形體感染均反應(yīng)，這 9 種斑點(diǎn)被用來當(dāng)作弓形體感染的標(biāo)記，其中 7 種標(biāo)記可用作區(qū)別疾病的不同階段。

（3） 新抗生素作用機(jī)理的研究：在新抗生素作用機(jī)理的研究方面， 2DE 技術(shù)發(fā)揮了重要作用，因現(xiàn)在細(xì)菌對(duì)大多數(shù)抗生素都有了抗藥性，而用于臨床的抗生素幾乎都是原有抗生素的衍生物，而目前這種狀態(tài)有所改變，在研究抑制核糖體類抗生素對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制時(shí)，對(duì) 12 種作用于翻譯過程的不同階段和核糖體內(nèi)不同分子的抗生素加以考察，發(fā)現(xiàn)其中 8 種誘導(dǎo)冷休克反應(yīng)的一系列蛋白質(zhì)，另 4 種誘導(dǎo)一系列熱休克反應(yīng)的蛋白質(zhì)，因此預(yù)計(jì)新的作用于核糖體的化合物也是誘導(dǎo)這兩種反應(yīng)，并且藉此可推測(cè)大腸桿菌對(duì)冷熱的反應(yīng)發(fā)生于核糖體水平上。

　　由此可見雙向電泳技術(shù)在蛋白質(zhì)組與醫(yī)學(xué)研究中所處的重要位置，它在分離蛋白質(zhì)譜的應(yīng)用引起了蛋白質(zhì)生化和功能分析方法的復(fù)興。我們相信隨著蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)體系的不斷改進(jìn)和發(fā)展，為人類從蛋白質(zhì)水平上揭開生命活動(dòng)規(guī)律的那一天終究會(huì)早日到來。