在現在的ELISA試劑盒血清樣本的加入幾乎是要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關鍵點是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區，易導致非特異吸附。濺出會對鄰近孔產生污染。出現氣泡則反應液界面有差異。試劑的加入在國產試劑盒中基本上均是從滴瓶中滴加，除了要注意滴加的角度外，滴加的速度也很重要，滴加太快，很容易出現重復滴加或加在兩孔之間的現象，這樣就會在孔內的非包被區出現非特異吸附，從而引起非特異顯色。所以，有時候一份標本用相同的試劑盒這次測定為陽性，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致。

      溫育這一步是臨床ELISA試劑盒測定中容易出現問題的步驟。通常目前國內ELISA試劑盒商品試劑盒的反應溫育時間為37℃ 30分鐘～1小時，進口ELISA試劑盒則通常為37℃ 1～2小時才能有較*的結合，低于1小時，可能會影響測定下限。因此，關于溫育，在實際測定操作中一定要注意以下幾點：

（1）要保證在設定的溫度下有足夠的反應時間。一般來說，加完樣本和/或反應試劑后，將微孔板從室溫拿至水浴箱或溫箱中時，孔內溫度從室溫升至37℃，需要一定的時間，尤其是在室溫比較低以及非水浴的狀態下，這段升溫時間可能還比較長，而在臨床實驗室中，很少有人注意這個問題，通常是將微孔板一放入溫箱即開始計時，這樣就很容易造成實際測定中溫育時間不夠，弱陽性樣本測不出來的問題。曾有一地處南方的血站同行提出了一個問題，就是在每一年的冬季總有那么一個多月的時間，在做HBsAg測定的室內質控中，測定由衛生部臨床檢驗中心供應的1 ng/ml弱陽性樣本時，總是測不出來，不知原因為何？這可能就與南方冬天室內溫度較低有關，此時微孔板轉入溫箱后37℃溫育時間不夠，以致弱陽性樣本測定為陰性。因此，為保證37℃下足夠的溫育時間，臨床實驗室可自行確定本實驗室不同季節（不同室溫下）微孔板從室溫拿至溫箱后需要多長時間孔內溫度才能達到37℃，從而適當延長板條在溫箱中的放置時間。具體的做法是，用一小溫度計放置板孔反應溶液中測量觀察即可。

（2）溫育溫度的選擇。在有的ELISA試劑盒的說明書中，指出溫育溫度可有兩種，例如，一種是37℃下1小時，另一種則為43℃下45分鐘。從免疫測定的抗原抗體反應的本質來看，在較低的溫度下反應較長的時間為*。如2～8℃下反應24小時。較高的反應溫度，由于分子運動的加憐惜，反應時間縮短，這一點對分子含量較多的強陽性樣本的測定沒有問題，但對分子含量少的弱陽性樣本則有漏檢的可能。因此，我們建議在臨床ELISA測定中盡量使用較低溫育溫度較長反應時間的條件。

（3）“邊緣效應"的排除。以前在使用96孔板的ELISA測定中，常發現有“邊緣效應"，即外周孔顯色較中心孔深，產生這種“邊緣效應"的原因可能為96孔板周孔與中心孔表面或熱力學特征的不同。但有研究證實在溫育中的熱力學梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導體，在實驗室的常規ELISA測定中，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學梯度。因此使用水浴或在將反應溶液加入至板孔中時，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃），就可以很容易地排除“邊緣效應"，并且可提高測定的重復性。

      總而言之，在臨床ELISA試劑盒測定中，要保證好的測定效果，可采用下述簡單辦法來確保溫育條件，即盡量采用水浴，溫育中讓微孔板浮于水面上，或將浸透水的沙布放入一大飯盒中成一濕盒，放于溫箱中，這樣就會因為板條孔底部直接與37℃水或濕布的接觸，以及水浴箱或濕盒內的高溫度，而使反應溶液的溫度迅速與溫室平衡。