枯草芽孢桿菌常用培養基配制方法

枯草芽孢桿菌原生質體的制備

1L蒸餾水+20g葡萄糖+15g蛋白胨+5g氯化鈉+0.5g牛肉膏+20g瓊脂

1 培養枯草芽孢桿菌  
    取親本菌株T4412、TT2 新鮮斜面分別接一環到裝有液體*培養基（CM）的試管中，36℃振蕩培養14 h，各取1 mL 菌液轉接入裝有20 mL 液體*培養基的250 mL 錐形瓶中，36℃振蕩培養 3 h，使細胞生長進入對數前期，各加入25 u/mL 青霉素，使其終濃度為0.3 u/mL，繼續振蕩培養2 h。  
2. 收集細胞  
    各取菌液10 mL，4000 r/min 離心10 min，棄上清液，將菌體懸浮于磷酸緩沖液中，離心。如此洗滌兩次，將菌體懸浮10 mL SMM 中，每mL 約含108～109 活菌為宜。  
3. 總菌數測定  
    各取菌液0.5 mL，用生理鹽水稀釋，取10-5、10-6、10-7 各1mL（每稀釋度作兩個平板）、傾注*培養基，36℃培養24 h 后計數。此為未經酶處理的總菌數。  
4. 脫壁  
    二株親本菌株各取5 mL 菌懸液，加入5 mL 溶菌酶溶液，溶菌酶濃度為100 ug/mL，混勻后于36℃水浴保溫處理30 min，定時取樣，鏡檢觀察原生質體形成情況，當95%以上細胞變成球狀原生質體時，用4000 r/min 離心10 min，棄上清液，用高滲緩沖液洗滌除酶，然后將原生質體懸浮于5 mL 高滲緩沖液中。立即進行剩余菌數的測定。  
5. 剩余菌數測定  
    取0.5 mL 上述原生質體懸液，用無菌水稀釋，使原生質體裂解死亡，取10-2、10-3、10-4 稀釋液各0.1 mL，涂布于*培養基平板上，36℃培養24～48 h，生長出的菌落應是未被酶裂解的剩余細胞。  
    計算酶處理后剩余細胞數，并分別計算二親株的原生質體形成率。原生質體形成率＝未經酶處理的總菌數一酶處理后剩余細胞數。