非放射性標記原位雜交技術的興起和發展，為雙重標記原位雜交提供了有效的技術途徑。在將放射性核素和非放射性物質標記的兩種探針結合進行的雙重標記原位雜交技術中，常用的放射性核素標記物為35 S，常用的非放射性標記物為生物素。該雙重原位雜交技術可分為一步法和二步法兩種。抗體

在一步法中，原位雜交反應用兩種探針的混合物一次完成，顯示雜交信號時，先用堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素與雜交體上的生物素結合，并用硝基四氮唑(NBT)和5―溴―4―氯―3―吲哚―磷酸鹽(BCIP)作為底物顯示雜交體上的堿性磷酸酶(或用ABC法顯示雜交體上的生物素)或以堿性磷酸酶標記的抗抗體與雜交體上的結合，并用NBT和BCIP顯示堿性磷酸酶，標本脫水干燥后再進行放射自顯影處理以顯示另一靶核酸。一步法的優點是雜交反應一次完成，操作流程較短，同一細胞內的兩種信號容易分辨；缺點是放射自顯影的陽性信號要比單標時明顯減少，堿性磷酸酶或ABC的陽性反應產物有可能會引起核乳膠的化學顯影。

在二步法中，先后使用不同的探針進行兩次雜交反應，一般先用35 S標記探針進行原位雜交，放射自顯影顯示*種雜交體后再用生物素標記的探針進行第二次原位雜交，按生物素―親和素―堿性磷酸酶法(或ABC法)―抗抗體―堿性磷酸酶法顯示第二種雜交體。二步法的雜交信號在鏡下明顯可辨。用放射性核素標記探針進行*次原位雜交的整個操作順序，包括放射自顯影的顯影定影過程，不會改變mRNA的結構，也不會影響第二次雜交反應時靶核酸對探針的可及性。二步法的整個操作流程要比一步法長，但它沒有一步法中存在的放射性標記信號的丟失，以及堿性磷酸酶(或ABC)陽性反應產物可能引起乳膠化學顯影的弊端。