背景： 因實驗需要，于2008年07月04日初次做肝臟組織ZO-1（一種胞膜蛋白，緊密連接蛋白）免疫熒光染色，以前我對酶免疫組化非常熟悉，在園子內也有不少置頂貼和精華帖，但免疫熒光一直還沒做過（原理知道，但細節不太了解）。我先用石蠟切片做了5次，結果一直不理想（表現為未見特異性強染色）；近幾日，我又切了冰凍切片，做了2次，終于基本成功了。

    在這個過程中，我對免疫熒光染色技術有了全新的認識，而前些天發出免疫熒光求助貼，回復的很少，所以有必要加強對免疫熒光方面的討論），不妥之處敬請指正。有人會問酶免疫組化做的好好的，為何要做免疫熒光？其實，這也是我以前思考的難題，現在我認為可能胞膜蛋白含量不高，用普通免疫免疫組化可能做不出來，需要敏感的免疫熒光方法來進行蛋白檢測（我是看許多外文文獻都是這樣做的，因此選擇免疫熒光染色。）

問題及其解答：如何降低非特異性熒光染色和避免陰性著色？
1、非特異性染色產生原因及其解決方案：

（1）游離熒光素殘留在二抗中。一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。二抗配置時用透析法或層析法分離熒光素標記的二抗和游離的二抗。購買高質量、高純度的熒光素二抗。

（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。

（3）組織抗原封閉不全。除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。延長血清封閉時間。

（4）從組織中難于提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗 體，以致容易混淆。

（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附于正常組織上而呈現非特異性染色。

（6）熒光素不純、標本固定不當等。

（7）一抗和二抗孵育條件和濃度不合適。調整一抗和二抗孵育條件和濃度至*。

（8）一抗和二抗孵育后的清洗不充分。增加清洗次數和延長清洗時間。