一、原理與意義

    免疫熒光組織（細胞）化學染色方法——間接法，是一種熒光抗體染色法。該方法只需制備一種熒光抗體可以檢出多種抗原，敏感性較高，操作方法較易掌握，而且能解決一些不易制備動物免疫血清的病原體（如麻疹）等的研究和檢查，所以已被廣泛應用于自身抗體和感染病人血清的試驗。

二、操作流程

（一）雙層法（Double Layer Method）

1、切片固定后用毛細滴管吸取經(jīng)適當稀釋的免疫血清滴加在其上，置于染色盒中保持一定的濕度，37℃作用30min。然后用0.01mol/L pH7.2 PBS洗兩次，10min，用吸水吸去或吹干余留的液體。

2、再滴加間接熒光抗體（如兔抗人γ-球蛋白熒光抗體等），同上步驟，染色30min，37℃，緩沖鹽水洗兩次10min，攪拌，緩沖甘油封固，鏡檢。

3、對照染色

①抗體對照：用正常兔血清或人血清代替免疫血清，再用上法進行染色，結(jié)果應為陰性。

②抗原對照：即類屬抗原染色，亦應為陰性。

③陽性對照。

（二）夾心法：未標記的特異性抗原加在切片上先與組織中之相應抗體結(jié)合，再用該抗原之熒光抗體重疊結(jié)合其上，而間接地顯示出組織和細胞中抗體的存在，方法步驟如下：

1、切片或涂片固定后，置于染色濕盒內(nèi)。

2、滴加未標記的特異性抗原作用切片于37℃，30min。

3、緩沖鹽水洗2次，每次5min，吹干。

4、滴加特異性熒光抗體再用切片于37℃，30min。

5、如③水洗。

6、緩沖甘油封固，鏡檢并拍照。