小干擾RNAs（small  interfering  RNAs，siRNAs）是RNA干擾（RNA  interference，RNAi）過程中的效應分子.Fire  et  al[1]在1998年向秀麗隱桿線蟲中注射雙鏈RNA（double-stranded  RNA，dsRNA）分子后降解了細胞質中含有同源序列的靶mRNA.隨后的研究表明，RNAi現象廣泛存在于真菌、擬南芥、斑馬魚、果蠅、小鼠及大鼠等大多數真核生物中.早期在哺乳動物細胞中應用長dsRNA可引起非特異性干擾素反應而導致細胞死亡，后來遺傳學和生物化學研究證明將dsRNA切割成21-28個核苷酸的siRNAs后不引起干擾素反應，并能有效降解含有同源序列的靶mRNA.

1、siRNAs的沉默機制

    siRNAs是由RNase-III家族中被稱為Dicer的核酸內切酶在細胞質中剪切自然存在的長dsRNA的過程中產生的.Dicer將長dsRNA剪切為21-28個核苷酸的siRNA雙鏈.這種siRNA雙鏈除了在5’末端是磷酸，3’末端是羥基外，3’端還有由2個核苷酸構成的懸突.siRNA雙鏈與誘導沉默復合物（RNA-induced  silencing  complex，RISC）結合后裂解為siRNA單鏈，與siRNA單鏈*互補結合的同源性靶mRNA被RISC剪切降解，從而達到基因沉默的目的.現在siRNA能夠像核酶一樣通過化學合成的方法或者通過載體表達雙鏈短發夾樣RNA（short  hairpin-like  RNA，shRNA）進入到細胞內，后者在細胞內可轉化為siRNA而發揮基因沉默效應.一些研究證明siRNAs還有其他沉默機制，例如在幾種生物中能夠通過RNAi途徑修飾細胞染色質導致轉錄水平的基因沉默[2-3].

    miRNAs（microRNAs）是一類非編碼小分子RNA，具有和siRNAs相似的功能，調節細胞內基因表達.成熟的miRNA是由胞質中70個核苷酸組成的發夾樣結構前體剪切為21-22個核苷酸分子組成的單鏈.他們組裝成蛋白復合體（miRNP）后在核糖體內與mRNA3’端非翻譯區部分互補結合從而阻止mRNA的翻譯.如果與同源性靶mRNA*互補結合，那么miRNAs像siRNAs一樣能夠通過正反饋途徑循環降解靶mRNA.

2、siRNAs的基因沉默效率及其安全性

    各種基因沉默的方法是否能夠作用于靶目標仍然是其應用于治療的一個關鍵問題.Harborth  et  al[4]研究表明RNA結合蛋白，mRNA的二級結構和三級結構能夠影響siRNA的沉默效率.絕大多數研究都證實siRNAs比各種寡脫氧核苷酸（oligodeoxyribonucleic  acids，ODNs）更有效，并且作用時間更長.作用于同樣的靶目標siRNAs的半數zui大抑制濃度（IC50）比磷硫酰修飾的ODNs低100-1  000倍.盡管尚未對siRNAs與核酶和/或DNA酶的效率進行廣泛地系統性比較，但Drew  et  al[5]研究表明siRNAs比核酶和/或DNA酶更有效，且具有長發夾結構的RNA比錘頭結構的核酶能更強烈的抑制靶基因表達.

    低濃度的siRNAs就能啟動基因沉默的過程，因為他們能快速、特異性與RISC結合，從而減少了與非特異性蛋白結合的可能，這有利于減少siRNAs在治療中的非特異性反應.事實上已有研究證明轉染中等濃度的siRNAs并不引起全身非特異性反應[6].也有三項研究[7-9]認為siRNAs引起的非特異性反應與siRNAs的濃度、細胞類型、轉染試劑以及siRNAs的轉染方式有關.這些非特異性反應包括刺激基因亞型引起的干擾素反應，但研究并非像人們想象的那樣，所產生的干擾素反應并不影響細胞生長.

3、siRNAs的表達載體

    由于siRNAs既可以通過化學合成獲得，也可以通過載體表達，這使具有靶向性的藥物應用于基因治療成為可能.表達siRNAs的載體通常含有RNA聚合酶III啟動子（RNA  polymerase  III  promoter，pol  III）或RNA聚合酶II啟動子（pol  II）序列，首先轉錄生成與miRNA前體相似的shRNA，然后在細胞內變成siRNA發揮基因沉默效應.在活體內和培養組織細胞中應用表達siRNA的載體能夠長時間整合到基因組中并“敲除"內源性基因.許多研究證明腺病毒載體、腺相關病毒（adeno-associated  viral，AAV）載體、逆轉錄病毒載體及慢病毒載體都能有效轉染到活體內和培養細胞中.Shinagawa  et  al[10]研究表明含pol  II的表達載體能在體內產生由數百個堿基對構成的shRNA，而不誘導非特異性干擾素反應，這為siRNAs應用于哺乳動物提供了一種安全的新方法.

4、siRNAs在活體中的應用

    通過電穿孔、局部注射或靜脈注射的方法已經能夠成功地將化學合成的siRNAs、表達siRNAs的質粒以及表達siRNAs的病毒導入到哺乳動物細胞中.但很難評價哪種方法能更有效的引起基因沉默.經鼠尾靜脈高壓注射溶于生理鹽水的siRNA已經成功地將siRNA導入大鼠組織中，其中在肝中靶基因的沉默效率達90%以上，而在肺、腎、脾、胰中靶基因的沉默效率稍低[11-12].采用這種方法引起的基因沉默效應一般持續數天，在有些情況下可超過1  wk，并且基因沉默的效率因物種的差異而不同.

    表達siRNAs的病毒載體為研究哺乳動物的基因功能提供了新方法，更為治療人類主要疾病帶來了新希望.已經有幾種病毒被設計用于表達siRNAs.重組AAV能在哺乳動物分裂期細胞和靜止期細胞中長期表達siRNA.他們通常以附加體的形式隨機、低頻整合到宿主基因組中.有研究[13]表明向大鼠腦內注射表達siRNA的AAV載體能引起長達7  wk之久的基因沉默效應.在HIV感染的組織模型中表達siRNA病毒載體也被成功地應用于治療[14].

    現在又有幾種新的方法將siRNAs導入活體內.zui近有研究[15]表明大分子能夠促進幾種小分子物質經皮吸收，包括siRNAs分子.這將有利于siRNAs經皮吸收進入全身血液循環發揮治療性藥物的作用.將含siRNAs的氣溶膠導入肺內也能起到基因治療的作用[16].

5、以siRNAs為基礎的基因治療

    雖然siRNA在哺乳動物細胞中的應用僅僅4  a，但他正以飛快地速度發展成為基因治療的一種新方法.如果siRNAs通過尾靜脈高壓注射能有效到達肝臟，那么他將可以廣泛應用于治療各種肝病.通過沉默肝中內源性凋亡基因的表達，經抗凋亡酶Caspase-8或者抗Fas細胞死亡受體的siRNAs預處理的小鼠能有效預防各種試劑誘導的急性肝功能衰竭;用同樣的siRNA也能夠治療已經發生的肝損傷[11-12].siRNAs通過抑制病毒自身或者抑制病毒轉錄所必須的輔助因子達到抗病毒的目的.將乙型肝炎病毒（HBV）基因組和siRNAs共轉染可以有效降低HBV的復制水平和蛋白合成[17].Wohlbold  et  al[18]證明用siRNAs能有效沉默異常BCR-ABL融合基因表達，而不影響正常c-BCR和c-ABL的轉錄，這為治療Ph染色體陽性的慢性粒細胞白血病提供了新方法.

    在血漿中siRNAs雙鏈能抵抗核酸內切酶的降解作用，但這并不意味著他能夠穩定地存在于機體內.因為未被修飾的siRNAs不能迅速進入細胞內，或者與血漿蛋白親和力低而較早地被機體清除.如果不是通過表達siRNAs載體的方法，那么必須經過化學修飾的siRNAs才能更有效的作為基因治療的手段.有研究[19-20]正通過硫磷酰修飾siRNA提高細胞的攝取能力，從而增強基因沉默的效果.去年美國FDA已批準經過修飾的siRNAs進行臨床新藥試驗，用于治療與年齡相關的黃斑退行性改變（age-related  macular  degeneration）的患者[21].zui近Soutschek  et  al[22]經鼠尾靜脈注射膽固醇修飾的抗apoB  siRNA能有效沉默同源性靶基因的過度表達，并且證實經修飾的抗apoB  siRNA導致小鼠膽固醇水平降低的程度與apoB基因敲除小鼠的水平相近，這實現了siRNA作為靜脈注射性治療藥物的可能.

    siRNAs作為一種新的基因治療方法引起了許多研究者的興趣，在很大程度上是因為其作為細胞內源性基因表達調節物質的低毒性和特異性，另外一方面則是其比ODNs、核酶有更強的基因沉默效率.然而將siRNAs應用于臨床治療還存在一些挑戰，如將siRNAs導入細胞內的方法及如何獲得更率，如何避免脫靶現象及非特異性反應.因此，進一步深入研究RNAi的機制將會豐富我們對基因表達調控的認識，也將有利于基因治療的實際應用.