細胞的凍存
【概述】
    凍存細胞時要緩慢冷凍。因為細胞在不加任何保護劑的情況下直接冷凍時，細胞內外的
水分都會很快形成冰晶，冰晶的形成將引起一系列的不良反應。首先細胞脫水使局部電解質
濃度增高，pH 值改變，部分蛋白質由于上述因素而變性，引起細胞內部空間結構紊亂，細胞
內冰晶的形成和細胞膜系統上蛋白質、酶的變性，引起溶酶體膜的損傷使溶解酶釋放造成細
胞內結構成分的破壞，線粒體腫脹、功能喪失并造成細胞能力代謝的障礙。胞膜上的類脂蛋
白復合體在冷凍中易發生破壞引起胞膜通透性的改變、使細胞內容物喪失。細胞核內 DNA
也是冷凍時細胞易受損部分。如細胞內冰晶形成較多，隨冷凍溫度的降低，冰晶體積膨脹造
成 DNA 的空間構型發生不可逆的損傷性變化，而引起細胞的死亡。
    在細胞凍存時要盡可能的均勻地減少細胞內水分，減少細胞內冰晶的形成是減少細胞損
傷的關鍵。目前多采用甘油或者二甲基亞砜作為保護劑。這兩種物質在深低溫冷凍后對細胞
無明顯毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞，可以使冰點下降，提高細胞膜對水的通透性；加上緩慢冷凍方法可使細胞內的水分滲出細胞外，在胞外形成冰晶，減少細胞內冰晶的
形成，從而減少由于冰晶形成造成的細胞損傷。
【用品】
    胰酶、含血清培養基、DMSO（分析純）或無色新鮮甘油（667.83kPa 蒸汽高壓消毒）、
吸管、離心管、凍存管
【步驟】
[1] 用無菌吸管吸棄瓶內舊的培養基；
[2] 加入少量 PBS 沖洗二遍， 用胰蛋白酶把單層細胞消化下來，依據傳代的方法把細胞
懸液收集于離心管中，離心 1000 rpm，5-8 min；
[3] 小心棄上清液，加入配置好的凍存培養液，用吸管輕輕吹打使細胞均勻，然后將含有
細胞的凍存液轉移到無菌的凍存管中，每個凍存管加液 1-1.5 ml，細胞zui終密度為
（5—10）×106
/ml；
[4] 凍存管封口，做好標記，按照以下程序凍存：4℃，15min--20 min,﹣20℃ 30min--40
min，見細胞懸液結凍后，放入﹣80 ℃冰箱 3h 或過夜，之后置于液氮中。
【注意事項】
[1] 從增殖期到形成致密的單層細胞以前的培養細胞都可以用于凍存，但選擇對
數生長期細胞，已經長滿的細胞凍存復蘇后生存率很低。在凍存前一天換 1 次培
養液。
[2] 將標記好并裝入凍存管的支架，從液氮容器口緩緩放入，按 1℃/ min 的降溫速度，
在 30-40min 時間內使其到達液氮表面。再停 30min 后，直接投入液氮中。
[3] 細胞在凍存后要在短期內復蘇 1 次，觀察細胞對凍存的適應性。