(一)材料

1．動物及胚胎來源關(guān)中黑豬或長白雜豬配種6～9d后，采用腹中線切開術(shù)，無菌暴露其子宮角與卵巢，沖洗子宮角，收集胚胎。

2．ES培養(yǎng)液DMEM培養(yǎng)液(含4．5g／L葡萄糖)，補加10％NCS+0．01 mmol／LM2一麓基乙醇+20μg／ml胰島素+青霉素、鏈霉素。

3．ES消化液0．25％胰蛋白酶一0．04％EDTA。

4．飼養(yǎng)層細(xì)胞PMEF。

5．器具吸管、4孔培養(yǎng)板、3．5 cm玻璃培養(yǎng)皿。

(二)方法

1．將收集的豬胚胎接種于含有PMEF的平皿上，培養(yǎng)液為ES培養(yǎng)液，置37℃、5％CO2、飽和濕度的CO2孵箱中培養(yǎng)。

2．胚胎固定在一定位置，一端的滋養(yǎng)層細(xì)胞附著于飼養(yǎng)層，從附著處向四周鋪展，其鋪展的過程伴隨著細(xì)胞的快速增殖。形成ICM。當(dāng)ICM集落較小時，用細(xì)的玻璃針鉤ICM集落細(xì)胞的一端，將ICM細(xì)胞從飼養(yǎng)層表面剝離。豬的ICM形態(tài)改為團(tuán)狀、條狀和混合狀。

3．用0．25％胰蛋白酶一0．04％EDTA消化培養(yǎng)8～9d的ICM細(xì)胞，將增殖的ICM離散并移種人新的含有PMEF的4 孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24~48h后就會出現(xiàn)新的細(xì)胞集落。不具胚胎的ICM，所得的集落數(shù)目不等。

4．經(jīng)培養(yǎng)7d后再次傳代培養(yǎng)，觀察細(xì)胞集落出現(xiàn)的情況。此時常出現(xiàn)3種集落。ES樣集落：由小而圓的細(xì)胞構(gòu)成。O滋養(yǎng)層細(xì)胞集落：細(xì)胞間連接緊密，相互連接成一透明的膜狀結(jié)構(gòu)，在飼養(yǎng)層表面迅速鋪展，邊緣有橢圓形細(xì)胞，首尾相連，在集落周圍形成一圈，并以此為界與周同飼養(yǎng)層細(xì)胞相區(qū)別。O上皮細(xì)胞樣集落：此細(xì)胞始終呈扁平狀，集落周圍輪廓不清，與飼養(yǎng)層細(xì)胞無明顯界限，但細(xì)胞較大、胞質(zhì)較多、胞核較小、核仁不明顯。

5．挑取ES克隆，經(jīng)胰蛋白酶一EDTA消化分離，移種于新的飼養(yǎng)層細(xì)胞上繼續(xù)培養(yǎng)，此時記為*代．以后每4～5d傳代1次。

(三)注意事項

1.豬囊胚可吸附在STO細(xì)胞株上，但在此飼養(yǎng)層的細(xì)胞上豬的ICM不增殖，故分離豬ES應(yīng)采用PMEF細(xì)胞體為飼養(yǎng)層。

2．豬ES的培養(yǎng)通常采用DMEM(高糖)培養(yǎng)液，并加入血清。

3．在培養(yǎng)液中加入胰島素是因為胰島至少能促進(jìn)早期胚胎卵裂速度，并能增加胚胎發(fā)育過程中囊胚細(xì)胞的有絲分裂和減少細(xì)胞死亡，使囊胚細(xì)胞數(shù)目增加。