(一)主要實驗材料

1．材料生長至80％以上匯合的軟骨細胞層。

2．消化液O．25％胰酶溶液和O．02％EDTA溶液的混合液(體積1：1混合)。

3．培養(yǎng)液(pH7．2) 含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液，添加維生素C(50mg／L)、L一谷氨酰胺(300mg／L)、青霉素(10萬I U／L)、鏈霉素(100mg／L)。

4．培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶等器材。

(二)實驗方法

1．清洗細胞取生長成層的軟骨細胞培養(yǎng)瓶，吸去培養(yǎng)液，用Hanks液清洗一次，除去殘余培養(yǎng)液和血清。

2．消化細胞加入約2ml胰酶和EDTA混合消化液(以培養(yǎng)器皿大小而定)，于37℃條件下消化2～3min。當大部分細胞變圓、細胞間隙變大時，加入含血清的培養(yǎng)液以終止消化。

3．收集細胞并計數(shù)反復吹吸細胞呈細胞懸液并移人離心管中，1500r／min離心6min。棄去上清液，加入少許含血清的培養(yǎng)液，用旋渦振蕩器振蕩混勻。然后，加入一定量培養(yǎng)液．進行細胞計數(shù)，一般細胞濃度調(diào)至0．5～l×106／ml。

4．接種細胞通常按約為2×104／cm2的細胞密度進行接種，將接種后的培養(yǎng)瓶(皿)置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

(三)蛄果分析

1．傳代后的軟骨細胞大約在6h內(nèi)就可全部貼壁，24h可進入對數(shù)生長期而開始快速增殖。根據(jù)細胞接種密度不同，一般在3～5d可達到85％以上的匯合狀態(tài)。

2．傳代后的軟骨細胞比原代細胞體積略大，第1～3代細胞仍以多角形為主，分散生長．較少聚集成軟骨結(jié)節(jié)。因貼壁速度快，很少見到剛分裂后的圓形細胞。第4代以后的關(guān)節(jié)軟骨細胞增殖能力下降，逐漸出現(xiàn)梭形細胞和長梭形細胞，細胞達到匯合狀態(tài)的時間也逐斷延長。常規(guī)培養(yǎng)至第6～8代以后，細胞增殖能力迅速下降，細胞全部轉(zhuǎn)變?yōu)殚L梭形或肥大的不規(guī)則形，出現(xiàn)明屁的細胞老化或去分化特征。

(四)注意事項

1．原代軟骨細胞容易聚集成結(jié)節(jié)樣生長，傳代消化時不易形成單細胞懸液。因此，原代軟骨細胞在80％～85％匯合時進行傳代，以免接種不均勻。

2．該方法僅適用于軟骨細胞的短期培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4代以內(nèi)的軟骨細胞可基本保持軟骨細胞的生物學特性。如需在體外較長期地維持軟骨細胞的功能．則應加入TGF一B等生長因子或采用其他有利于維持軟骨細胞分化功能的培養(yǎng)體系，如立體培養(yǎng)、流體靜壓培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)等。