(一)主要實(shí)驗(yàn)材料

1．材料生長(zhǎng)至80％以上匯合的軟骨細(xì)胞層。

2．消化液O．25％胰酶溶液和O．02％EDTA溶液的混合液(體積1：1混合)。

3．培養(yǎng)液(pH7．2) 含10％FCS的DMEM培養(yǎng)液，添加維生素C(50mg／L)、L一谷氨酰胺(300mg／L)、青霉素(10萬(wàn)I U／L)、鏈霉素(100mg／L)。

4．培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶等器材。

(二)實(shí)驗(yàn)方法

1．清洗細(xì)胞取生長(zhǎng)成層的軟骨細(xì)胞培養(yǎng)瓶，吸去培養(yǎng)液，用Hanks液清洗一次，除去殘余培養(yǎng)液和血清。

2．消化細(xì)胞加入約2ml胰酶和EDTA混合消化液(以培養(yǎng)器皿大小而定)，于37℃條件下消化2～3min。當(dāng)大部分細(xì)胞變圓、細(xì)胞間隙變大時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)液以終止消化。

3．收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)反復(fù)吹吸細(xì)胞呈細(xì)胞懸液并移人離心管中，1500r／min離心6min。棄去上清液，加入少許含血清的培養(yǎng)液，用旋渦振蕩器振蕩混勻。然后，加入一定量培養(yǎng)液．進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，一般細(xì)胞濃度調(diào)至0．5～l×106／ml。

4．接種細(xì)胞通常按約為2×104／cm2的細(xì)胞密度進(jìn)行接種，將接種后的培養(yǎng)瓶(皿)置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

(三)蛄果分析

1．傳代后的軟骨細(xì)胞大約在6h內(nèi)就可全部貼壁，24h可進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期而開始快速增殖。根據(jù)細(xì)胞接種密度不同，一般在3～5d可達(dá)到85％以上的匯合狀態(tài)。

2．傳代后的軟骨細(xì)胞比原代細(xì)胞體積略大，第1～3代細(xì)胞仍以多角形為主，分散生長(zhǎng)．較少聚集成軟骨結(jié)節(jié)。因貼壁速度快，很少見到剛分裂后的圓形細(xì)胞。第4代以后的關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞增殖能力下降，逐漸出現(xiàn)梭形細(xì)胞和長(zhǎng)梭形細(xì)胞，細(xì)胞達(dá)到匯合狀態(tài)的時(shí)間也逐斷延長(zhǎng)。常規(guī)培養(yǎng)至第6～8代以后，細(xì)胞增殖能力迅速下降，細(xì)胞全部轉(zhuǎn)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形或肥大的不規(guī)則形，出現(xiàn)明屁的細(xì)胞老化或去分化特征。

(四)注意事項(xiàng)

1．原代軟骨細(xì)胞容易聚集成結(jié)節(jié)樣生長(zhǎng)，傳代消化時(shí)不易形成單細(xì)胞懸液。因此，原代軟骨細(xì)胞在80％～85％匯合時(shí)進(jìn)行傳代，以免接種不均勻。

2．該方法僅適用于軟骨細(xì)胞的短期培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4代以內(nèi)的軟骨細(xì)胞可基本保持軟骨細(xì)胞的生物學(xué)特性。如需在體外較長(zhǎng)期地維持軟骨細(xì)胞的功能．則應(yīng)加入TGF一B等生長(zhǎng)因子或采用其他有利于維持軟骨細(xì)胞分化功能的培養(yǎng)體系，如立體培養(yǎng)、流體靜壓培養(yǎng)、灌注培養(yǎng)等。