白提取和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒包含了蛋白提取試劑及SDS－PAGE凝膠電泳所需的試劑。其中包括RIPA裂解液，BCA蛋白定量試劑，5×蛋白上樣buffer，預染的蛋白Marker和 SDS-PAGE凝膠電泳試劑。
RIPA裂解液(RIPA Lysis Buffer)是一種傳統(tǒng)的細胞組織快速裂解液。RIPA裂解液裂解得到的蛋白樣品可以用于常規(guī)的Western、IP等。RIPA的本意是Radio Immunoprecipitation Assay。RIPA裂解液的主要成分為50mM Tris (pH 7.4)，150mM NaCl，1% Triton X-100，1% sodium deoxycholate，0.1% SDS，以及sodium orthovanadate，sodium fluoride，EDTA，leupeptin等多種抑制劑。可以有效抑制蛋白降解。
BCA蛋白濃度測定試劑zui常用的兩種蛋白濃度檢測方法之一BCA法研制而成，實現(xiàn)了蛋白濃度測定的簡單，高穩(wěn)定性，高靈敏度和高兼容性。BCA法測定蛋白濃度靈敏度高，檢測濃度下限達到25µg/ml，zui小檢測蛋白量達到0.5µg，待測樣品體積為1-20µl。

    在50-2000µg/ml濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系。
SDS-PAGE凝膠配制試劑提供了配制SDS-PAGE凝膠所需的各種試劑，用戶只需自備制膠器具和蒸餾水，即可配制PAGE膠了。SDS-PAGE凝膠配制試劑盒不僅可用于配制SDS-PAGE凝膠，也可用于配制非變性(native)PAGE凝膠。本試劑盒約可配制25塊常規(guī)大小的PAGE膠(即聚丙烯酰胺凝膠)。
應用方面：可用于Western Blotting中的蛋白提取和電泳的全過程。
 

二、試劑盒組份

5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液               

1 ml

-20℃

預染蛋白分子量 Marker（14.4-116KD）

三、試劑盒以外自備儀器和試劑

    手術(shù)剪，玻璃勻漿器，細胞刮，搖床，eppendorf管，渦旋振蕩器，微型高速冷凍離心機，分光光度計或酶標儀，酶標板，電泳裝置，1.5m L離心管，100mMPMSF，冰冷PBS，去離子水

四、保存條件：

    RIPA裂解液（強），5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，預染蛋白分子量 Marker（14.4-116KD）-20℃保存

蛋白標準溶液-20℃保存，BCA試劑A和BCA試劑B室溫保存。

    1M Tris-HCl, pH8.8、10% SDS、Ammonnium persulfate (過硫酸銨)和1M Tris-HCl, pH6.8室溫或4℃保存。30% Acr-Bis (29:1)和TEMED 4℃避光保存。

    過硫酸銨配制成10%溶液后（0.5g中加入4.5ml蒸餾水溶解），分裝成小管-20℃保存，通常半年內(nèi)有效。

 五、      操作規(guī)程

（1）用RIPA裂解液提取蛋白

注意事項：

1、   為取得的使用效果，盡量避免過多的反復凍融。可以適當分裝后使用。

2、   需自備PMSF。

3、   裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進行。

4、   有的樣本要通過一些預實驗來摸索的適合您實驗條件的裂解液。

5、   一般常規(guī)提取的蛋白樣品，進行后續(xù)試驗不需要透析，但如果需要較大量的提取蛋白或后續(xù)試驗結(jié)果不理想，則需要將提取的蛋白樣品進行透析脫鹽，建議使用透析液透析后進行后續(xù)分析。

6、   為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。蛋白提取和SDS-PAGE凝膠電泳試劑盒說明書

(一)        對于細胞

1、   RIPA裂解液（強）工作液的準備

 在每mL 冷RIPA裂解液（強）加入10μL 100mM PMSF混勻。冰上保存數(shù)分鐘待用。

2、   樣品的處理

A、  懸浮細胞

a、    離心（2000rpm，5min）收集細胞，盡zui大努力吸盡上清。

b、  用PBS洗一遍，離心（2000rpm，5min）吸盡上清，留下細胞沉淀備用。

c、    轉(zhuǎn)入第3步進行操作。

B、  貼壁細胞

a、    培養(yǎng)好的細胞吸去培養(yǎng)基后，加入10mL冷PBS洗兩次，每次振搖數(shù)次以盡量去除培養(yǎng)液。

b、   用細胞刮子刮下細胞，或用EDTA溶液（不含胰酶）處理細胞使細胞不再貼壁很緊，并用移液器吹打下細胞。

c、    將細胞溶液轉(zhuǎn)至新的冰冷離心管中，離心（2000rpm，5min）吸盡上清。

d、  用PBS洗一遍，離心（2000rpm，5min）吸盡上清，留下細胞沉淀備用。

e、    轉(zhuǎn)入第3步進行操作。

3、   加入上述配制好的冷RIPA裂解液（強）工作液加入量如下表所示：