糖基轉移酶分析

R&D Systems現已開發出一種多功能的非放射性檢測方法，能測定糖基轉移酶活性。分析使用了一種特定的磷酸酶，它釋放糖基轉移酶反應過程中產生的核苷酸上的磷酸。隨后利用孔雀石綠磷酸鹽檢測試劑來評估磷酸鹽水平。因為釋放的磷酸鹽濃度與轉移的糖分子量成正比，所以可測定糖基轉移酶的動力學參數。此外，這種顯色分析在96孔板中開展，適合高通量研究

糖基轉移酶是催化單糖基團從糖基供體向受體底物轉移的酶。其中大部分被歸為Leloir酶，它們利用核苷酸糖作為供體，并在反應中生成核苷酸磷酸鹽。分析糖基轉移酶活性相當具有挑戰性。zui常用的方法是檢測放射性標記的糖從供體轉移到受體分子。各種非放射性的檢測方法也被不斷開發；然而，它們中的大部分是為特定糖基轉移酶定制的。
為了證明這種技術的實用性，我們評估了Clostridium difficile毒素B（TcdB；圖2A）、人O-糖基轉移酶I（KC1；圖2B）和人ST6GAL1（圖2C）的酶活。TcdB和KC1是具有UDP-葡萄糖水解酶活性的糖基轉移酶，它們在反應中生成副產物UDP。磷酸酶CD39L3水解核苷酸β-磷酸鹽，并從UDP上釋放出游離的磷酸鹽。相比之下，ST6GAL1是唾液酸轉移酶，它催化了N聚糖中唾液酸從α2,6轉移到β 1-4GlcNAc結構。對于此反應，CMP-NeuAc充當供體底物，而N-乙酰乳糖胺（LN）則充當受體。利用5’核苷酸酶CD73從反應中產生的CMP上釋放出游離的磷酸鹽。對于這三種糖基轉移酶的反應，利用孔雀石綠檢測試劑測定游離磷酸鹽水平，以獲得相對供體底物濃度的特定活性（pmol/min/µg）的準確測定