一、培養製備
1: 在室溫或37±2℃的溫度下解凍外周血染色體同步化套裝培養管或培養瓶。
2: 在無菌條件下添加0.5ml全血至一個試管中或分配5ml瓶裝的介質到一個細胞培養瓶中并加入樣本。
3: 蓋上培養管的蓋子。
4: 混合培養管(或培養瓶)中的物質,水平放置(在它的平坦的表面上),并在37±2℃的溫度下溫育。沒有必要添加CO2, 因為該介質的構成就是為關閉系統中*的淋巴細胞擴散而設計的。
二、培養同步化
1: 經過48-72小時的培養后,添加0.1ml的溶液A并溫育一整夜。
2: 溫育后,添加0.1ml的溶液B并溫育5小時(沒有必要洗滌細胞)。
3: 添加20ul秋水仙素(10ug/ml),并在37±2℃的溫度下溫育60分鐘(大約)。如果要獲得更多數量的前中期分裂相,那可將溫育時間減少至15分鐘。
注意:經過同步化處理的細胞,進行G和R顯帶時,胰酶處理時間需要相應延長。
三、染色體固定和玻片製備
1: 溫育后,如有必要,將培養轉移至一個試管,并用離心機分離3-4分鐘,轉速為每分鐘2.000(更快的轉速不會損壞細胞)。
2: 倒掉上層清液,注意不要使細胞粒子松散(推薦留大約0.5ml的物質在試管內)。
3: 有力地重新懸掛粒子。
4: 添加5ml低滲液(滴入H2O、0.56%氯化鉀),并充分混合。
5: 在室溫下至少溫育7分鐘。
6: 用離心機分離3-4分鐘,轉速為每分鐘2.000。
7: 根據步驟2倒掉上層清液。
8: 有力地重新懸掛粒子。
9: 添加5ml Ibraimov溶液(滴入H2O、5%醋酸),并充分混合。
10: 立即用離心機分離3-4分鐘,轉速為每分鐘2.000。
11: 根據步驟2倒掉上層清液。
12: 有力地重新懸掛粒子。
13: 添加5ml固定液(甲醇:醋酸:3:1),并充分混合。
14: 重復步驟10-13。
15: 立即用離心機分離3-4分鐘,轉速為每分鐘2.000。
16: 仔細倒掉幾乎全部的上層清液。
17: 添加幾滴新準備的固定劑,要考慮到滴數應當適合粒子內的細胞濃度。
18: 滴一小滴細胞懸浮液到一塊干凈且濕潤的顯微鏡玻片上。
19: 放進Optichrome染色體分散儀(貨號: EKAMH950)內,在正確溫度和相對濕度的恒定條件下蒸發。
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