雙歧桿菌屬放線菌科雙歧桿菌屬,革蘭氏陽性桿菌,G+C%含量高,專性厭氧。在健康人體腸道內存在的多種細菌中,以雙歧桿菌發揮的生理功能zui為重要。該菌在維護腸道菌群平衡、抑制病原菌生長、抗衰老、抗腫瘤以及為人體提供多種營養素等方面發揮了作用。
　　
　　雙歧桿菌能通過合成乳酸和乙酸等物質調節腸道pH值,并依靠自身的黏附能力抑制外侵的多種腸道致病菌和條件致病菌的侵襲,預防和治療胃腸炎、結腸炎、壞死性小腸結腸炎以及慢性腸道感染等多種胃腸道疾病。然而,目前報道中關于雙歧桿菌與腸道細胞相互作用的研究很少,尤其是雙歧桿菌在腸道環境中的適應性機制的研究尚無報道。本研究中所用的長雙歧桿菌NCC2705分離自健康嬰兒的糞便,是與人體相關的雙歧桿菌中十分重要的一個菌株。
　　
　　瑞士雀巢公司的研究人員于2002年完成了該菌的基因組測序,使其成為*個遺傳背景清楚的雙歧桿菌,便于功能基因組學和蛋白質組學的研究。為研究長雙歧桿菌NCC2705在腸道內的適應性機制,我們利用家兔作為動物模型,將分別在家兔結腸內和家兔體外培養的長雙歧桿菌NCC2705進行了比較蛋白質組學研究。利用雙向凝膠電泳分離蛋白,并用ImageMaster2DElitePlatnum軟件對電泳結果進行分析。研究發現,在經過家兔體內培養后,長雙歧桿菌NCC2705的全基因組蛋白中共有38個蛋白點表達豐度發生了3倍以上的變化,同時有4對蛋白點在膠圖上發生了位置的遷移,可能是蛋白質翻譯后修飾的結果。此后,我們對這38個表達差異的蛋白點及位移的蛋白點,用MALDI-TOF-MS和/或ESI-MS/MS進行質譜鑒定,并利用半定量RT-PCR進行了驗證。結果表明,該38個蛋白點代表了33種蛋白,與體外培養相比,體內培養的長雙歧桿菌有19個蛋白上調,14個蛋白下調,4個蛋白發生了位置遷移。這些差異蛋白包括應激蛋白、能量代謝相關蛋白以及翻譯相關蛋白等。我們對一些與長雙歧桿菌NCC2705腸道適應性相關的關鍵蛋白進行了分析:在體內環境中培養,膽鹽水解酶比在體外培養表達豐度提高了5.2倍。膽鹽水解酶能催化水解甘氨酸和牛磺酸共軛結合膽鹽,釋放氨基酸并使膽鹽失活形成膽酸,使益生菌避免了膽鹽的毒害作用。該酶在益生菌與體內環境交互作用的初期,以及在機體腸道對游離氨基酸的利用和腸道抗膽鹽毒害的過程中發揮了重要作用。延伸因子EF-Tu在體內培養后,表達豐度增加超過5倍。它是一種新型表面蛋白,主要在蛋白質合成過程中發揮作用,具有黏附因子的特征并誘導促炎癥反應。
　　
　　其它體內培養過程中的上調說明該蛋白在細菌的定植和黏附過程中發揮了作用。此外,應激蛋白包括:與蛋白折疊、聚集和降解相關的應激蛋白（GroEL）,觸發因子的伴侶分子（Tig）和ATP依賴的Clp蛋白酶水解亞單位2蛋白（ClpP2）,它們在家兔體內培養后表達豐度均明顯增加,主要作用在于避免長雙歧桿菌受腸道內各種有害因素的影響,得以在腸道內苛刻的條件下存活。雙歧桿菌寄居于胃腸道,是通過其*的BifidShunt途徑進行糖酵解的。在本研究中,該途徑的相關酶中有3個酶在雙歧桿菌經體內培養后表達豐度升高,它們分別是醛糖轉移酶、酮糖移轉酶和核糖5-磷酸異構酶,這表明長雙歧桿菌NCC2705充分利用了這些酶快速生長來參與腸道內的菌群競爭。本研究中位置發生遷移的4個蛋白分別是:GlnA1、PurC、LuxS和Pgk,進一步利用Pro-QDiamond磷酸化蛋白膠染色和WesternBlot的方法,對遷移蛋白點的磷酸化修飾進行了驗證和分析。結果顯示,Pgk和LuxS兩個蛋白發生了磷酸化作用。長雙歧桿菌NCC2705中的Pgk被磷酸化并形成磷酸化中間體發揮作用;LuxS是密度感應系統中信號分子AI-2產生過程中的關鍵酶,該蛋白在體內環境中磷酸化修飾作用增強。我們推測磷酸化形式可能是LuxS的一種活性形式,即LuxS-P,該酶以這種形式在雙歧桿菌的密度感應系統中發揮了關鍵的作用。通過前面蛋白質組學的研究,我們發現了一些在雙歧桿菌適應腸道環境過程中發揮了關鍵作用的蛋白,這些蛋白增強了雙歧桿菌對周圍不利環境的適應能力。此外,我們還發現四個位置發生遷移的蛋白,其中與細菌種間交流信號分子AI-2的產生密切相關的LuxS蛋白發生了磷酸化,這一現象表明其在雙歧桿菌適應腸道環境、與其它菌群進行信息交流過程中可能發揮作用。因此,我們針對長雙歧桿菌NCC2705中LuxS蛋白是否具有功能,該菌是否能分泌具有活性的信號分子AI-2進行了研究。我們利用對AI-2特異的哈氏弧菌BB170報告系統檢測長雙歧桿菌NCC2705和LuxS過表達菌中AI-2的分泌及活性。實驗發現,長雙歧桿菌NCC2705的luxS基因能在大腸桿菌中表達。通過對長雙歧桿菌NCC2705和LuxS過表達重組菌中的AI-2進行檢測,發現長雙歧桿菌NCC2705和重組菌均能分泌信號分子AI-2使哈氏弧菌BB170發出熒光,且AI-2的分泌量在一定范圍內與雙歧桿菌菌群密度呈正相關。這一結果表明,長雙歧桿菌NCC2705中LuxS蛋白具有活性,并存在依賴于luxS/AI-2的QS系統,能夠分泌群體感應信號分子AI-2。本研究詮釋了長雙歧桿菌NCC2705在腸道中的適應性機制,利用家兔作為腸道模型研究雙歧桿菌在腸道內的生理性變化,并結合蛋白質組學和磷酸化染色等方法對該菌在機體內、外條件下的蛋白表達變化進行了有效比較。此外,本研究對長雙歧桿菌NCC2705的群體感應系統信號分子AI-2的存在以及其產生過程中的關鍵酶LuxS的功能活性進行了研究和驗證。
　　
　　長雙歧桿菌NCC2705腸道適應性機制研究