成纖維細胞培養(yǎng)基微絲的染色及其對細胞松馳素B的反應(yīng)

　　(一)原理

　　微絲普遍存在于多種細胞培養(yǎng)基，對細胞的形狀和運動有一定作用。細胞松馳素B可與微絲的亞單位肌動蛋白結(jié)合，從而破壞微絲，改變細胞的形狀。

　　(二)細胞松馳素B處理成纖維細胞與染色觀察

　　1．在平皿中有三張成纖維細胞貼壁生長的蓋片，在超凈工作臺內(nèi)將一張蓋片移入另一皿中繼續(xù)培養(yǎng)，用作對照。

　　2．在有兩片的平皿內(nèi)加100μg／ml的細胞松弛素B 4滴繼續(xù)培養(yǎng)半小時。

　　3. 將用細胞培養(yǎng)基松弛素B處理過的兩張蓋片取一張做染色處理，另一張用培養(yǎng)液洗五次（在平皿內(nèi)換五次培養(yǎng)液，每次都要搖動），繼續(xù)培養(yǎng)、觀察。兩小時后細胞形狀恢復(fù)，接近正常。

　　4．對恢復(fù)的蓋片與*張沒用藥的蓋片一同做染色處理。

　　5．染色處理

　　①將需染色的蓋片放入盛有PBS的平皿內(nèi)用吸管輕輕吹洗蓋片，換液三次，每次3分鐘，洗去培養(yǎng)液。

　?、趯⑸w片移入2％Triton X一100液，置37℃恒溫箱內(nèi)處理20～30分鐘，以提取骨架以外的蛋白質(zhì)，使骨架圖像清晰。

　　③立刻將蓋片移入M一緩沖液，換洗三次，每次3分鐘。M一緩沖液有穩(wěn)定細胞骨架的作用。

　?、軐⑸w片移入3％戊二醛固定15分鐘。

　?、輰⑸w片移入0.2％考馬斯亮蘭染液中，染色15分鐘。然后小心地用自來水沖洗，空氣干燥。

　　(三)結(jié)果

　　光鏡觀察，微絲聚集成的張力纖維束被染成藍色。在沒用藥的標本上，成纖維細胞培養(yǎng)基多數(shù)有突起，微絲沿突起規(guī)則排列；用細胞松馳素B處理的標本，由于微絲被破壞突起縮回，多數(shù)細胞形狀變圓；用藥處理后又洗去藥的標本，由于解除了藥的作用，肌動蛋白重新聚臺形成微絲，細胞形狀恢復(fù)正常。