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活體染色與死的鑒定實(shí)驗(yàn)

時(shí)間:2011-3-9閱讀:2534
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  【實(shí)驗(yàn)原理】
  
  活體染色是利用某種對(duì)植物無害的染料溶液對(duì)活細(xì)胞進(jìn)行染色的技術(shù)。中性紅是常用的活體染料之一,它是一種弱堿性pH指示劑,變色范圍在pH6.4~8.0之間(由紅變黃)。
  
  在中性或微堿性環(huán)境中,植物的活細(xì)胞能大量吸收中性紅并向液泡中排泌,由于液泡在一般情況下呈酸性反應(yīng)。因此,進(jìn)入液泡的中性紅便解離出大量陽離子而呈現(xiàn)櫻桃紅色,在這種情況下,原生質(zhì)和細(xì)胞壁一般不著色;死細(xì)胞由于原生質(zhì)變性凝固,胞液不能維持在液泡內(nèi)。因此,用中性紅染色后,不產(chǎn)生液泡著色現(xiàn)象。相反,中性紅的陽離子,卻與帶有一定負(fù)電荷的原生質(zhì)及細(xì)胞核結(jié)合,而使原生質(zhì)與細(xì)胞核染色。
  
  【儀器與用具】
  
  顯微鏡;小培養(yǎng)皿;載玻片;蓋玻片;單面刀片;尖頭鑷子;酒精燈;火柴;擦鏡紙;吸水紙適量。
  
  【實(shí)驗(yàn)試劑】
  
  0.03%中性紅溶液;1mol/L硝酸鉀溶液。
  
  【實(shí)驗(yàn)方法】
  
  1.選用洋蔥鱗莖(或大蔥假莖基部)及小麥葉片作材料。
  
  2.切下一片較幼嫩的洋蔥鱗片,用單面刀片在鱗片內(nèi)側(cè)割劃成0.5cm2左右的小塊,用尖頭鑷子將內(nèi)表皮小塊輕輕撕下,即可投入中性紅溶液染色(注意應(yīng)將表皮內(nèi)側(cè)向下)。若用小麥葉片為材料,可將葉片背面朝上平放在載玻片上,再將此載玻片放入盛有少量清水的培養(yǎng)皿內(nèi),用左手將葉片按平,右手用刀片從一個(gè)方向輕輕刮去下表皮和葉肉部分,只留下透明的上表皮細(xì)胞。當(dāng)刮到只剩下少量葉肉細(xì)胞時(shí)要十分小心,用力太重容易損傷表皮細(xì)胞,甚至只剩下一層細(xì)胞壁,太輕又會(huì)留下過多的葉肉細(xì)胞,影響觀察。除小麥外其他禾本科植物也可用此法制備表皮細(xì)胞,將刮好的材料切成約0.5cm2小塊。
  
  3.將制好的洋蔥鱗莖內(nèi)表皮或小麥葉片上表皮小塊投入0.03%的中性紅溶液中染色5~10min,取出1~2片,在蒸餾水中稍加沖洗,在載玻片上滴一滴蒸餾水,小心地將制片平展到載玻片上,加蓋玻片,在顯微鏡下觀察,可看到細(xì)胞壁被染成紅色,而原生質(zhì)和液泡均不染色,這是因?yàn)檎麴s水偏酸,在弱酸性條件下細(xì)胞壁帶負(fù)電荷和染料陽離子發(fā)生吸附的結(jié)果。
  
  4.將步驟3中的活體染色制片取出幾片放入pH略高于7.0的自來水中浸泡10~15min,再置于載玻片上鏡檢,將發(fā)現(xiàn)細(xì)胞壁脫色,而液泡卻被染成深紅色,這是因?yàn)樵谌芤簆H高于7.0的情況下,中性紅分子的解離作用很弱,主要以分子狀態(tài)存在,不易被細(xì)胞壁吸附,但較易透過質(zhì)膜和液泡膜進(jìn)入液泡,而植物的細(xì)胞液多呈酸性反應(yīng),進(jìn)入液泡的中性紅于是發(fā)生解離,將液泡染成櫻桃紅色。此時(shí)細(xì)胞核和原生質(zhì)不染色。
  
  為了確證中性紅染色部位,可將上述洋蔥內(nèi)表皮染片浸入1mol/L的硝酸鉀溶液中浸泡10min左右,然后取出觀察。由于硝酸鉀能使原生質(zhì)強(qiáng)烈膨脹,發(fā)生“帽狀質(zhì)壁分離”,因而能清楚地區(qū)別開無色透明的原生質(zhì)和染成紅色的液泡。
  
  5.將步驟4中的活體制片放在酒精燈火焰上微微加熱,以殺死細(xì)胞,再在顯微鏡下觀察,會(huì)看到原生質(zhì)凝結(jié)成不均勻的凝膠狀,與細(xì)胞核一起被染成紅色。
  
  6.在活體染色制片中仔細(xì)尋找,可能看到個(gè)別死細(xì)胞,其細(xì)胞核因被中性紅染色而呈紅色,清晰可辨。

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