一．畢赤酵母表達(dá)常用溶液及緩沖液的配制
1．1 各種母液的配制
10*YNB （含有硫酸銨、無氨基酸的13.4%酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基） 4℃保存。34g酵母基礎(chǔ)氮源培養(yǎng)基（無硫酸銨）+100g硫酸銨，溶于1000ml水中，過濾除菌。
500*B     （0.02%生物素 Biotin）   4℃保存 保存期為1年。20mg的生物素溶于100ml水中，過濾除菌。
100*H     （0.4%Histidine 組氨酸） 4℃保存 保存期為1年。400mg的L-組氨酸溶于100ml水中，（加熱至50℃以促進(jìn)溶解），過濾除菌。
10*D （20%Dextrose 葡萄糖） 保存期為1年。200g葡萄糖溶于1000ml水中，滅菌15min或過濾除菌。
10*M （5%Methanol   甲醇） 保存期為2個(gè)月。將5ml的甲醇與95ml水混勻，過濾除菌。
10*GY （10%Glycerol   甘油） 保存期為1年以上。將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。
100*AA （0.5% of each Amino Acid，各種氨基酸）   4℃保存 保存期為1年。分別將500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸和L-異亮氨酸溶于100ml水中，過濾除菌。
1M 磷酸鉀溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），將1mol/L的K2HPO4溶液132ml與1mol/L的KH2PO4溶液868ml混勻，其pH為6.0，如需調(diào)節(jié)pH，則使用磷酸和氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH。
1.2 常用溶液及緩沖夜
1.2.1 堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA所用溶液：
溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI （pH 8.0）
溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％ SDS（臨用時(shí)配制）
溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。
4℃保存。
1.2.2 10% 甘油 （Glycerol）：
將100ml甘油和900ml水混勻后，高壓滅菌或過濾除菌。保存期為1年以上。
1.2.3   Rnase-H2O：
1ul Rnase 加入1ml 滅菌 dd H2O。4℃保存。
1.2.4   TE緩沖液：
10mmol / Tris-CI（pH 8．0）， lmmol / L   EDTA（pH 8.0）
1.2.5   STE緩沖液：
0.1mol / L,   10mmol / L Tris-HCl （pH 8.0）, 1mmol / L EDTA （pH 8.0）
1.2.6   SCE緩沖液：
1mol / L Sorbitol （山梨醇）, 10mmol / L 檸檬酸鈉 ， 10mmol / L EDTA
1.2.7   1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：
    132 ml 1M   K2HPO4
    868 ml 1M   KH2PO4
1.2.8 50X TAE 瓊脂糖凝膠電泳緩沖液，pH 8.0（1L）：
   242 g Tris
   57.1 ml Acetic Acid
   37.2 g EDTA
二．畢赤酵母表達(dá)的培養(yǎng)基配制
2.1   LB（Luria－Bertani）培養(yǎng)基：
Trypton     l％
 Yeast Extract 0.5％
 NaCl    l％
 PH 7.0
制作平板時(shí)加入 2％瓊脂粉。121℃高壓滅菌 20min。可于室溫保存。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌*0F’時(shí)可加入Zeocin 25ug / ml。
2.2   LLB（Low Salt LB）培養(yǎng)基：
Trypton     l％
 Yeast Extract 0.5％
 NaCl     0.5％
 PH 7.0
制作平板時(shí)加入 2％瓊脂粉。121℃高壓滅菌 20min。可于室溫保存數(shù)月。用于培養(yǎng)pPICZαA原核宿主菌*0F’時(shí)，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃條件下保存1～2周。
2.3   YPD （又稱YEPD）
Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培養(yǎng)基）
Trypton    2%
dextrose （glucose） 2%
+agar        2%
+Zeocin 100 µg/ml
液體YPD培養(yǎng)基可常溫保存；瓊脂YPD平板在4℃可保存幾個(gè)月。加入Zeocin 100ug / ml，成為YPDZ培養(yǎng)基，可以4℃條件下保存1～2周。
2.4   YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：
yeast extract     1%
peptone    2%
dextrose （glucose） 2%
sorbitol    1 M
+agar        2%
+ Zeocin    100 µg/ml
不管是液體YPDS培養(yǎng)基，還是YPDS + Zeocin 培養(yǎng)基，都必須存放4℃條件下，有效期1～2周。
2.5   MGY
Minimal Glycerol Medium （zui小甘油培養(yǎng)基）
（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。將800ml滅菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B母液和100ml的10*GY母液混勻即可，4℃保存，保存期為2個(gè)月。
2.6   MGYH
Minimal Glycerol Medium + Histidine （zui小甘油培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）
在1000ml的MGY培養(yǎng)基中加入10ml的100*H母液混勻，4℃保存，保存期為2個(gè)月。
2.7   RD
Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培養(yǎng)基）
（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）
1. 將186g的山梨醇定容至700ml，高壓滅菌；
2. 冷卻后于45℃水浴；
3. 將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液和88ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟2的山梨醇溶液混合。4℃保存。
2.8   RDH
Regeneration Dextrose Medium + Histidine （葡萄糖再生培養(yǎng)基 + 0.004%組氨酸）
在RD培養(yǎng)基配制的第三步中，在加入10ml的100*H母液，同時(shí)無菌水的體積減少至78ml即可，其余配制方法與RD相同。4℃保存。
2.9   RD及RDH平板的制備
1. 將186g的山梨醇和15~20g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60℃水浴；
2. 參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；
3. 迅速制備平板。4℃可保存數(shù)月。
2.10   RD及RDH 的TOP 瓊脂的制備（常用于酵母菌的包被）
1.將186g的山梨醇和7.5~10g瓊脂粉定容至700ml，高壓滅菌；冷卻后于60℃水浴；
2.參照RD/RDH液體培養(yǎng)基配制的步驟4，將100ml的10*D、100ml的10*YNB；2ml的500*B；10ml的100*AA等母液、（10ml的100*H母液）和88（78）ml無菌水混勻，預(yù)熱至45℃后，與步驟1的山梨醇/瓊脂液混勻；
3.將該TOP瓊脂置于45℃水浴冷卻、保溫，備用。
2.11   MD與MDH
Minimal Dextrose Medium +（Histidine）   zui小葡萄糖培養(yǎng)基 +（ 0.004 %組氨酸）
（含有：1.34%YNB；；4*10-5% 生物素；2%葡萄糖）
1. 100ml的10*YNB；2ml的500*B和100ml10*D母液，用800ml的無菌水定容至1000ml即可；
2. 如配制MDH，可在上述的MD中加入10ml的100*H即可；
3. 如配制平板，可無菌水的滅菌前，加入15~20g的瓊脂。4℃可保存數(shù)月。
2.12   SOC培養(yǎng)基：
Trypton       l％
Yeast Extract    0.5％
NaCl       0.05％
Glucose （1mol / L）     2%
121℃高壓滅菌 20min，冷卻后，4℃保存
三．主要試驗(yàn)環(huán)節(jié)的操作
3.1 酵母菌株的分離純化
接種GS115于5ml YPD液體培養(yǎng)基，30℃，200rpm振蕩過夜，涂布 YPD平板，30℃培養(yǎng)48 小時(shí)，用 YNB基本培養(yǎng)基和含His的補(bǔ)充培養(yǎng)基作點(diǎn)種分離純化，挑選在補(bǔ)充培養(yǎng)基生上生長而在基本培養(yǎng)基上不生長的單菌落劃YPD平板，4℃保存。
3.2 pPICZαA原核宿主菌*0F’的活化培養(yǎng)
*0F’做為菌種保存在－70 ℃條件下，在進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)抽提質(zhì)粒之前，先要進(jìn)行活化培養(yǎng)。
接種*0F’于5ml LLB（加入25ug / ml Zeocin）中，37℃，200 rpm ，培養(yǎng)16～18小時(shí)。
3.3畢赤酵母表達(dá)的試驗(yàn)方法
3.3.1線狀質(zhì)粒DNA的脫磷酸化處理
為了防止載體質(zhì)粒DNA的自身環(huán)化，用小牛腸堿性磷酸酶（CIP）處理酶切后的質(zhì)粒DNA，具體操作如下：
⑴ 建立反應(yīng)體系：
線性化的質(zhì)粒     35ul
10x CIP buffer   4ul
CIP              1ul
ddH2O            5ul
——————————————————————————
total     45ul
⑵ 在PCR儀上控制反應(yīng)溫度（加石蠟油封閉），37℃，15 min ；50℃，15 min；56℃，30 min（滅活）。
⑶ 在56℃未開始前停止，加入proteinse K ，用于滅活CIP，加入試劑如下：
反應(yīng)物           45ul
10x 5％ SDS       7ul
10x EDTA （pH 8.0） 7ul
proteinse K       5ul
 ddH2O           6ul   
———————————————————
  total       70ul
⑷ 純化使用QIAquick spin kit ，按照2.2.3.3步驟進(jìn)行，20 ul 滅菌ddH2O洗脫純化產(chǎn)物。進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，120 V， 觀察純化結(jié)果，并大約估計(jì)DNA濃度。
3.3.2   E.coli *0F’ 感受態(tài)細(xì)胞的制備及轉(zhuǎn)化
⑴ 取10 ul *0F’ 菌液，接種于 200ml LB液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)，37℃ ，200 rpm，16～18小時(shí)。取100 ul菌液接種于 200 ml 液體LB培養(yǎng)基中。
⑵ 37℃ ，200 rpm，培養(yǎng)16～18小時(shí)。
⑶ 滅菌500 ml 離心管，4℃，4000 rpm，20 min 。得菌體沉淀。棄上清，菌體用10％甘油重懸并洗滌。重復(fù)洗滌3次。
⑷ 第三次離心后，棄絕大部分上清，留下約1ml 液體用于重懸菌體。
⑸ 從制得得感受態(tài)細(xì)胞中，取200 ul于滅菌EP管中，加入連接反應(yīng)產(chǎn)物 5ul ，混勻，不要產(chǎn)生氣泡，在冰上放置 5 min。
⑹ 將混勻后得200ul菌液移入電擊杯中。
⑺ 使用電擊穿孔儀進(jìn)行轉(zhuǎn)化，設(shè)置為 電壓 2500 V，時(shí)間 5 ms。
⑻ 電擊后，往電擊杯中加入 800ul SOC培養(yǎng)基，沖洗出菌體，轉(zhuǎn)移至滅菌1.5 ml EP管中。37℃，150 rpm ，輕搖45～60 min。
⑼ 取全部均勻涂布于含 Zeocin 25 ug/ml 的LLB－Zeocin平板上，正放，待涂布液不在流動(dòng)，37℃ 培養(yǎng)12～16小時(shí)。
*注：設(shè)空載體做對(duì)照。
3.4   畢赤酵母電轉(zhuǎn)化方法
3.4.1 菌體的準(zhǔn)備：
1. 挑取酵母單菌落，接種至含有5ml YPD培養(yǎng)基的50ml三角瓶中，30℃、250~300r/min培養(yǎng)過夜；
2. 取100~500µl的培養(yǎng)物接種至含有500ml新鮮培養(yǎng)基的2L三角搖瓶中，28~30℃、250~300r/min培養(yǎng)過夜，至OD600達(dá)到1.3~1.5；
3. 將細(xì)胞培養(yǎng)物于4℃，1500g離心5min，用500ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
4. 按步驟3離心，用250ml的冰預(yù)冷的無菌水將菌體沉淀重懸；
5. 按步驟3離心，用20ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸；
6. 按步驟3離心，用1ml的冰預(yù)冷的1mol的山梨醇溶液將菌體沉淀重懸，其終體積約為1.5ml；
7. 備注：可將其分裝為80µl一份的包裝冷凍起來，但會(huì)影響其轉(zhuǎn)化效率（2周之內(nèi)）。
3.4.2 電擊轉(zhuǎn)化：http://www.cmr6829.com/Login/default.aspx?Stand_DownLoadOperate
8. 將5~20µg的線性化DNA溶解在5~10µl TE溶液中，與80µl的上述步驟6所得的菌體混勻，轉(zhuǎn)至0.2cm冰預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；
9. 將電轉(zhuǎn)化杯冰浴5min；
10. 根據(jù)電轉(zhuǎn)化儀提供的資料，參考其他文獻(xiàn)及多次摸索，確定合適的電壓、電流、電容等參數(shù)，按優(yōu)化的參數(shù)，進(jìn)行電擊http://www.cmr6829.com/Login/default.aspx?Stand_DownLoadOperate；
11. 電擊完畢后，加入1ml冰預(yù)冷的山梨醇溶液將菌體混勻，轉(zhuǎn)至1.5ml的EP管中；
12. 將菌體懸液涂布于MD或RDB平板上，每200~600µl涂布一塊平板；
13. 將平板置于30℃培養(yǎng)，直至單個(gè)菌落出現(xiàn)。
推薦：電壓1.5kV；電容25µF；電阻200Ω。電擊時(shí)間為4～10msec。