膠體金免疫標(biāo)記技術(shù)

膠體金的制備
根據(jù)不同的制備方法，可以制備出直徑1－500nm的膠體金粒子，但做為免疫標(biāo)記探針，其直徑應(yīng)在3-30nm范圍內(nèi)。
在氯化金（HAuCl4）水溶液中加入還原劑使之還原并聚積形成膠體金粒子。使用不同種類、不同劑量的還原劑，可以控制所產(chǎn)生的粒子大小。即粒子大小取決于反應(yīng)溶液中zui初還原試劑和還原核的數(shù)量。還原劑濃度越高，核濃度也越高，氯化金的還原也就從更多的還原中心開始，因此產(chǎn)生的膠體金粒子數(shù)量越多，但體積也越小。粒子直徑每增加一倍，數(shù)量減少為原來的1/8。
以檸檬酸鈉和單寧酸做還原劑，能夠制備大小相對一致、直徑3～16nm的膠體金。因此一般膠體金探針均使用該方法進(jìn)行。但該方法制備的膠體金粒子直徑范圍較窄，而且殘留的多聚單寧酸殘基往往干擾某些蛋白與金粒子的結(jié)合。此時在溶液中添加0.1～0.2％的H2O2能夠去除這些殘基。雙標(biāo)記或制備5-10 nm的膠體金時建議使用該方法。
利用檸檬酸為還原劑，可以制備12～150 nm直徑的膠體金。但制備大體積的膠體金時，膠體金粒子的誤差也同時增加。因此做單標(biāo)記時，建議使用該方法制備12-16 nm直徑的膠體金。
除了上述方法外，也可以用磷作為還原劑來制備5 nm的膠體金，它避免了單寧酸殘基的問題，但所形成的金粒子體積變化較大。磷易燃且有毒，制備的殘液需進(jìn)一步處理，故該方法已經(jīng)很少使用。
氯化金極易吸濕，故一般均以小劑量密封保存（0.5g或1g），因此在配制氯化金溶液時一次配完，暫時不用的可以用1.5 ml試管分裝為1 ml保存（-20℃）。注意各種玻璃器皿一定要洗凈并用雙蒸水多次沖洗，有條件時可硅化處理（1％雙氯硅烷/浸泡1小時，烘干）。配制各種試劑時均使用雙蒸水，隨后再用0.22 ?m微孔濾膜過濾后使用。三角瓶可反復(fù)多次使用，不用時應(yīng)密封保存，以防污染。
制備好的膠體金保存壽命較長，可4℃保存6個月以上或室溫下保存1-2個月。當(dāng)出現(xiàn)明顯懸浮物或沉淀后表示已不可再用。但無論無何，在保存較長時間后應(yīng)進(jìn)行鏡檢，如出現(xiàn)大量膠體金粒子凝集，說明已經(jīng)過期
1、單寧酸/檸檬酸鈉法制備3～16 nm膠體金
（1）      取一250 ml三角瓶，加入79 ml雙蒸水和1 ml 1％氯化金，預(yù)熱至60～70℃。
（2）      取一50 ml燒杯，加入4 ml 1％檸檬酸鈉，然后根據(jù)所制備金粒子體積大小加入不同用量的單寧酸及等量的25 mM K2CO3。預(yù)熱至60～70℃。K2CO3的作用是保持溶液的中性pH。因此如果單寧酸的量少于0.5 ml時，對pH的影響不大，K2CO3可以省略。
（3）      將上兩種溶液迅速混合并充分混勻，加熱至沸并保溫10分鐘。自然冷卻。
檸檬酸鈉（ml）      單寧酸（?l）      膠體金（nm）
4      5000      3
4      2000      4
4      500      6
4      120      8
4      70      10
4      10      16

2、白磷還原法制備5 nm膠體金
（1）      取250 ml三角瓶一個，加79 ml雙蒸水，1 ml 1%氯化金，并用0.25 M K2CO3將溶液調(diào)至中性（pH7.0）。
（2）      取0.2 ml飽和磷/乙醚溶液加到1.5 ml試管中，再加0.8 ml乙醚，混勻。取0.7 ml加入溶液（1）中（磷有毒且易燃，操作請帶手套，多余的磷溶液用CuSO4進(jìn)行中和）。
（3）      室溫下輕輕搖勻15 min，然后加熱沸騰并保持5 min，自然冷卻。

3、檸檬酸三鈉法制備12-30 nm膠體金（Frens, 1973）
（1）      取250 ml三角瓶一個，加100 ml雙蒸水及1 ml 1%氯化金，加熱沸騰；
（2）      取不同量的1%檸檬酸鈉加入上述溶液中。混勻，再保持沸騰30 min，溶液顏色首先變黑，再逐漸變紅，粒子體積較小時，溶液呈桔紅色，而粒子體積較大時，則顏色偏向紫色。

注 意：
（1）      由于使用試劑質(zhì)量及其它方面可能存在的誤差，以及制備過程中的其它問題，膠體金粒子的大小及一致性與理論值可能有偏差，因此，在制備完成后必須進(jìn)行鏡檢。如出現(xiàn)粒子體積偏差太大，粒子凝聚，粒子邊緣不清晰等問題，須重新制備。
（2）      膠體金溶液保存在4℃冰箱中；也可保存在室溫下，一般可保存1-2個月。但決不可保存在0℃以下，否則金粒子發(fā)生凝聚。