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【原理】

ELISA雙抗體夾心法的原理是將特異性抗體結合到固相載體上形成固相抗體，然后和待檢血清中的相應抗原結合形成免疫復合物，洗滌后再加酶標記抗體，與免疫復合物中抗原結合形成酶標抗體-抗原-固相抗體復合物，加底物顯色，判斷抗原含量。現上海恒遠生物科技有限公司技術以檢測HbsAg為實例為您詳細講解。

 

【材料】

酶標抗體（HRP-抗HBs-IgG）、抗HBs-IgG、待檢血清

包被液 pH9.5 0.05 mol/L CB

稀釋液 pH7.4 0.02 mol/L Tris-HCl緩沖液

底物液 0.1 mol/L Na2HPO4（Na2HPO4?12H2O 35.8 g/L）5.14 ml，0.05 mol/L枸櫞酸（10.5g/L）4.86 ml混勻，加入鄰苯二胺（OPD）4 mg，置棕色小瓶中，臨用時加30% H2O2 4.0μl，混勻。

終止液 2 mol/L H2SO4

溫箱、酶標反應板、酶標分光光度計

 

【方法】

1． 包被 取包被液適當稀釋的抗HBS-IgG 0.1 ml，加到聚苯乙烯反應板各孔中。加蓋，4℃ 24h。次日用洗滌液充分洗滌3次，甩干。

2． 各孔內加不同稀釋倍數的待檢血清0.1 ml，同時加陽性和陰性對照血清，置43℃溫箱60 min，移去液體。同前法洗滌3次，甩干。

3． 各孔內加稀釋HRP-抗HBs-IgG 0.1 ml，置43℃溫箱60 min。移去液體，同前法洗3次，甩干。

4． 各孔加底物液0.1 ml，置黑暗處20 min。

5． 各孔內加2 mol/L H2SO4 0.05 ml，終止反應。

 

【結果】

1． 目測法 陽性孔呈桔黃色，陰性孔無色或極淺黃色。

2． 比色法 用酶標分光光度計測A492nm，計算P/N值（為待測血清A492nm和陰性對照A492nm的比值）。如P/N2.1，結果為陽性，否則為陰性。

ELISA簡便、敏感、特異。并酶標記抗體試劑制備容易、穩定、有效期長、因此推廣很快，ELISA雙抗體夾心法，但僅適用于二價或二價以上的大分子抗原的檢測。