試劑反應條件的初步確定
試劑反應條件的初步確定
對一種診斷試劑而言，首先需要確定其包被物的濃度，一般包被物在微孔板表面形成單層時，能獲得zui穩定的包被效果，包被物濃度過低時，如果不采取一定的措施，將升高試劑的非特異性反應，而包被物濃度過高時，包被物之間的相互作用過于緊密，導致其敏感性和精密性的降低(Cantarero et a1．，1980)。因此，應該根據包被物的性質和特點，選擇合適的包被方法和包被濃度。一般選擇包被濃度為O.5ug/ml(1～10ug/m1)，然后對酶標記物的工作濃度進行選擇(Voller et a1．，1979)。同時為了減少試劑的非特異性，除包被緩沖液外的緩沖液中一般應添加一定濃度的去垢劑。由此初步確定試劑的反應工藝，并依據此工藝，利用HIV抗體陽性樣品(如HIV不同感染階段的樣品、不同基因型的HIV-1感染者樣品等)、HIV抗體陰性樣品(包括HBV、HCV等HIV-l相關病毒感染者樣品和正常人樣品等)等對試劑的敏感性、特異性以及精密性進行評價，依據評價結果，對試劑進行初步的優化。
(一)對試劑的包被條件進行優化
包被物包被于微孔板，主要依賴于包被物和微孔板之間的疏水作用，因此，應該依據試劑的初步評價結果，合理對包被條件進行優化。
如果試劑的精密性較低，其可能原因一般包括：實驗操作方面的原因、Tip頭的原因、包被物濃度過高導致蛋白質之間的相互作用太強等進而影響檢測的靶物質與包被物的結合作用。另外，包被物與微孔之間的相互作用太弱也可能導致精密性的降低。優化時，首先應采取一定的措施，提高包被物和微孔之間的相互作用力，以提高包被效果，具體措施包括：在包被緩沖液中添加特定的化學組分(如6mol／L鹽酸胍)以暴露包被物的疏水區(Lewis et a1．，1992)，或者增加包被緩沖液的離子強度，以屏蔽包被物之間的排斥作用，增強包被物和微孔之間的疏水作用力。在此基礎上，對包被條件進行優化，但是，在優化過程中應該考慮包被物本身的性質及其對試劑敏感性等可能造成的影響。
(二)非特異性的優化
試劑的非特異性主要是由于被檢測的靶物質和微孔之間的非特異性結合造成的，因此，在工藝上應盡量減少這種非特異性的結合。可以考慮以下方面的影響：洗滌次數及浸泡時間的影響，一般可選擇的洗滌條件為洗滌5或6次，浸泡時間30~60s，如果洗滌次數過多，可能在降低非特異性的同時，還會降低試劑的特異性結合，進而對試劑的敏感性和精密性產生不利的影響；選擇合適的封閉蛋白，防止非特異性結合，實際應用中，采用酪蛋白進行封閉可以獲得較低的檢測背景；在*步孵育步驟中添加去垢劑同樣能降低試劑的非特異反應。
(三)對*步孵育條件進行優化
由于包被物存在于固相支持物(微孔板)上，因此，被檢測的靶物質在液體中的擴散速度可能會影響抗原抗體之間的結合作用。一般可通過增加反應時間、提高反應溫度、對微孔板進行振蕩等方法加速抗原抗體之間的結合反應。同時，應該對試劑反應的動力學特點進行調查分析，選擇適宜的反應條件(時間、溫度等)。
