免疫印跡操作步驟
1．主要內(nèi)容
檢測限為2—20fmol，或約0．1～lng的50kDa蛋白質(zhì)
有多個操作步驟，需2天(或1天)時間完成。
檢測抗原的存在，定量及其大小。
半定量至全定量。
抗原的檢測依賴于耐變性的表位。
一般，低親和力抗體亦可使用。
2．操作步驟
(1)將蛋白質(zhì)溶解于Laemmli樣品緩沖液中。zui終的樣品緩沖液條件是2％SDS、100mmol／LDTT(從lmol／L的儲存液中取出，臨用前加入，該儲存液置于—20℃冷凍保存)、60mmol／LTris(pH6．8)、0。01％溴酚藍和10％甘油。全細胞可直接放在樣品緩沖液中進行溶解；純化或部分純化的溶液可用2％的樣品緩沖液1：1進行稀釋。加熱至70℃ 10min。zui終蛋白質(zhì)濃度應(yīng)不超過150ug／每孔(微型膠不超過15pg／每孔)。
(2)將樣品放在SDS聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，移去平板，將凝膠剪成適當(dāng)大小以進行轉(zhuǎn)印。在凝膠上作記號以確定方向。
(3)剪1張硝酸纖維素膜和4張吸附濾紙(Whatman 3MM或替代物)，其大小與凝膠相當(dāng)。
(4)將硝酸纖維素膜放入蒸餾水中潤濕。將膜轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)印緩沖液中浸泡5min。將吸水紙浸泡于轉(zhuǎn)印緩沖液中。轉(zhuǎn)印緩沖液1(20 000～400 000kDa蛋白質(zhì))：48mmol／LTris，390mmol／L*、0．1％(w／v)SDS、20％甲醇加蒸餾水至1000ml。轉(zhuǎn)印緩沖液2(<80 000kDa蛋白質(zhì))：25mmol／LTris、190mol／L*、20％甲醇加蒸餾水至1000ml。
(5)將凝膠、印跡膜、濾紙和支持墊浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中使其*浸泡。小心地將支持墊中的氣泡排出。
(6)組裝轉(zhuǎn)印夾層組合：依次為支持墊、2張吸水紙、凝膠、膜、2張吸水紙和支持墊。將組裝好的夾層組合放入轉(zhuǎn)印槽中，并使膜靠近正極(陽極，紅色電極)。
(7)于4C條件下轉(zhuǎn)印過夜。分子質(zhì)量>100 000kDa的蛋白質(zhì)，先在28V轉(zhuǎn)印1h，然后在84V轉(zhuǎn)印14～16h。分子質(zhì)量<100 000kDa的蛋白質(zhì)，63V轉(zhuǎn)印4～16h。
(8)轉(zhuǎn)印完成后，斷開電源。卸下夾層組合裝置，并在硝酸纖維素膜上作記號以保持原來的方向。
(9)用PBS將膜清洗數(shù)次。
(10)在室溫下將膜放入5％脫脂奶粉／PBS中攪動孵育2h。然后從封閉液中取出印跡膜并用PBS漂洗2次，每次5min。
(11)加入一抗溶液。15cmXl5cm印跡膜用10ml。所有的溶液均用3％BSA／PBS進行稀釋。
(12)在室溫下將膜和抗體攪動孵育1h。用PBS將膜漂洗4次，每次換液洗5rain。
(13)加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗試劑。所有的溶液均用3％BSA／PBS進行稀釋。對組織培養(yǎng)上清可以不稀釋或1：10稀釋。這樣獲得的抗體濃度為1Ps／ml和50ug／ml。如果是多克隆抗血清或腹水，將10ul稀釋至10ml即可。如果抗體的濃度尚未知，需作若干稀釋度以確定正確的濃度范圍。
(14)在室溫下攪動孵育1h。用PBS將膜漂洗4次，每次換液洗5min。
(15)在臨用前，新鮮配制化學(xué)發(fā)光試劑。由于該試劑的半衰期非常短，故應(yīng)按需配制。將膜放入此液內(nèi)孵育lmin。
(16)用紙巾吸去印跡膜邊緣或邊角部分過多的化學(xué)發(fā)光試劑。將印跡膜放入塑料袋中以確保干的表面與膠片接觸。
(17)將印跡膜在暗室中使膠片曝光lmin。沖洗膠片以確定待測抗原的正確曝光時間。曝光時間可短至幾秒鐘，也可長達數(shù)小時。
