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小鼠ELISA檢測試劑盒的操作流程

閱讀:96發(fā)布時間:2014-07-29

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小鼠ELISA檢測試劑盒

檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)。往預先包被小鼠H5N1(H5N1)捕獲抗原的包被微孔中,依次加入標本、標準品、HRP標記的檢測抗體,經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色,TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色,并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的小鼠H5N1(H5N1)呈正相關。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度(OD 值),計算樣品濃度。
樣品收集、處理及保存方法
1.  血清:使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管,操作過程中避免任何細胞刺激,收集血液后,3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2.  血漿:EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。
3.  細胞上清液:3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4.  組織勻漿:將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。
5.  保存:如果樣本收集后不及時檢測,請按一次用量分裝,凍存于-20℃,避免反復凍融,在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
酶標儀(450nm)
高精度加樣器及槍頭:0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱
操作注意事項
  試劑盒保存在2-8℃,使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結晶,這屬于正常現(xiàn)象,水浴加熱使結晶*溶解后再使用。
  實驗中不用的板條應立即放回自封袋中,密封(低溫干燥)保存。
  預處理后的樣本無需稀釋,直接取10μL加樣即可。
  嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作。
  所有液體組分使用前充分搖勻。操作步驟
  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,剩余板條用自封袋密封放回4℃。
  設置標準品孔、樣本孔和空白孔,空白孔什么都不加;標準品孔各加不同濃度的標準品50μL;
  待測樣本孔先加待測樣本10μL,再加*40μL;
  隨后標準品孔和樣本孔中(空白孔不加)加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的檢測抗體50μL,,用封板膜封住反應孔,37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
  棄去液體,吸水紙上拍干,每孔加滿洗滌液,靜置1min,甩去洗滌液,吸水紙上拍干,如此重復洗板5次(也可用洗板機洗板)。
  所有孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
  所有孔加入終止液50μL,15min內(nèi),在450nm波長處測定各孔的OD值。

試劑盒性能

1.  準確性:標準品線性回歸與預期濃度相關系數(shù)R值,大于等于0.9900。

2.  靈敏度:zui低檢測濃度小于1.0 pg/ml。

3.  特異性:不與其它可溶性結構類似物交叉反應。

4.  重復性:板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于15%。

5.  貯藏:2-8℃,避光防潮保存。

6.  有效期:6個月

7.  檢測范圍:31.2pg/ml-1000pg/ml


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