血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗體

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免疫學(xué)技術(shù)正沿著基礎(chǔ)研究－應(yīng)用研究－高技術(shù)開(kāi)發(fā)研究3條主線在開(kāi)展，上海撫生生物血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗體正推動(dòng)著技術(shù)平臺(tái)的發(fā)展。

詳細(xì)介紹

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗體單克隆抗體的免疫抗原，從純度上說(shuō)雖不要求很高，但高純度的抗原使得到所需單抗的機(jī)會(huì)增加，同時(shí)可以減輕篩選的工作量。因此，免疫抗原是越純?cè)胶茫瑧?yīng)根據(jù)所研究的抗原和實(shí)驗(yàn)室的條件來(lái)決定。
熒光素標(biāo)記
A、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記FITC標(biāo)記抗體的原理是在堿性條件下，F(xiàn)ITC 的異硫氰基能與IgG的自由氨基結(jié)合，形成IgG與熒光素的結(jié)合物。FITC是zui常用的熒光素，其次選用TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）。FITC和TRITC是常用的雙標(biāo)記組合。 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抗體其標(biāo)記步驟如下：
a. 以碳酸鹽緩沖液（PH9.3，Na2CO3 8.6g，NaHCO3 17.3g，蒸餾水1000ml）調(diào)整抗體濃度至10mg/ml。
b. 取5ml抗體溶液置于10ml小燒杯中。
c. 稱(chēng)取1mg FITC溶于0.2ml DMSO中，待溶解后立即緩慢滴加于抗體液內(nèi)，邊加邊輕攪；其后室溫避光作用2小時(shí)。
d. 將交聯(lián)物經(jīng)Sephadex G25或G50柱層析除去游離的熒光素；分管收集*峰為標(biāo)記的抗體。
e. FITC的結(jié)合物質(zhì)量鑒定IgG量（mg/ml）=（OD280-OD495×0.35）/1.4F/P=2.87×OD495/（OD280-OD495×0.35），一般說(shuō)，F(xiàn)ITC對(duì)抗體的摩爾比為3：1時(shí)適合于組織切片染色，為5-6：1時(shí)適合于細(xì)胞懸液染色。以標(biāo)記抗體染色各種抗原，測(cè)定其特異性染色滴度和非特異染色的程度。
f. 標(biāo)記抗體的保存：宜保存于4℃，加NaN3防腐。
B、異硫氰酸羅丹明（TRITC）標(biāo)記: 基本與FITC標(biāo)記相同。
同位素標(biāo)記
必須強(qiáng)調(diào)的是在使用同位素標(biāo)記單抗或其他蛋白之前，應(yīng)掌握同位素操作和防護(hù)知識(shí)。正常情況下應(yīng)包括避免物理的接觸和對(duì)γ-射線照射的有效保護(hù)，操作和使用同位素標(biāo)記抗體時(shí)，應(yīng)利用防護(hù)裝置，并合理處置含放射性的廢料。
A、碘標(biāo)記用碘標(biāo)記抗體是一種有效的標(biāo)記方法。125I衰變產(chǎn)生低能的γ和Χ射線，很容易被檢測(cè)出來(lái)，而其60天的半衰期保證足夠的有效使用期，且能很方便地處理放射廢料。zui常用的碘標(biāo)記方法是氯胺T法，即將氧化劑氯胺T加入到抗體和碘化物的溶液中，Na125I在氯胺T作用下I轉(zhuǎn)化成I2，游離I2可與抗體分子中*和一些*發(fā)生鹵化反應(yīng)，用還原劑和游離*終止反應(yīng)，經(jīng)凝膠過(guò)濾將標(biāo)記的抗體與碘化*及還原劑分離開(kāi)。其主要操作步驟如下：
a. 在進(jìn)行標(biāo)記之前，先選用截流分子量為20000-50000的凝膠，制備1ml凝膠柱，然后分別用10倍體積的1%BSA/PBS/0.02%疊氮鈉和PBS洗滌柱體，封住柱下口，備用。
B、b. 加入10ug純化單抗至含有25ul 2.5mol/L磷酸鈉（PH7.5）的1.5ml指形管內(nèi)。隨后，加入500uCi Na125I混勻。
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氯化鈉結(jié)晶紫增菌液
Sodium Chloride Violet purple Enrichment Broth
氯化鈉蔗糖瓊脂
Sodium Chloride Sucrose Agar
嗜鹽菌選擇性瓊脂
Halophilic Bacteria Selective Agar
氯化鈉血瓊脂基礎(chǔ)
Sodium Chloride Blood Agar Base
霍亂雙糖鐵瓊脂（KIA）
T1N1 瓊脂
T1N1 Agar
T1N0 肉湯
T1N0 Broth
T1N3 肉湯
T1N3 Broth
*葡萄糖斜面瓊脂
Arginine Dextrose Agar
mCPC 培養(yǎng)基
mCPC Medium
mCPC培養(yǎng)基添加劑
mCPC Medium Supplement
副溶血性弧菌瓊脂
副溶血性弧菌增菌液
C、c. 加入25ul新配制的2mg/ml氯胺T。室溫放置60秒。再加入50ul氯胺T終止液（含2.4mg/ml偏重亞硫酸鈉，10mg/ml*，10%甘油和0.1%環(huán)乙烷酰二甲苯的PBS）。
D、d. 將上述碘標(biāo)記物上樣在凝膠柱表面，小心放開(kāi)柱體下口，用1.5ml指形管收集。當(dāng)?shù)鈽?biāo)記物全部進(jìn)入柱體，加入0.3ml含0.03%疊氮鈉的PBS，用另一指形管收集0.3ml，然后再加0.3ml 0.03% NaN3 PBS，下口收集0.3ml，重復(fù)進(jìn)行，同時(shí)用同位素檢測(cè)儀測(cè)定標(biāo)記與未標(biāo)記的單抗。標(biāo)記抗體大約在第二至第四管出現(xiàn)。無(wú)害化處理柱子和非單抗標(biāo)記部分。e. 將標(biāo)記單抗保存于4℃可使用6周時(shí)間。
B、生物合成法標(biāo)記將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)在含有放射性前體的培養(yǎng)基中，隨著抗體分子的合成、組裝，同位素會(huì)標(biāo)記在抗體分子的初級(jí)氨基酸鏈上，本方法不會(huì)導(dǎo)致抗體活性的喪失。其主要步驟是：
a. 離心收集處于對(duì)數(shù)生*的雜交瘤細(xì)胞，約需2×106個(gè)細(xì)胞。以預(yù)熱37℃不含*的培養(yǎng)基洗滌上述細(xì)胞。
b. 用含2% PBS不含*的培養(yǎng)基懸浮雜交瘤細(xì)胞至106個(gè)/ml，加入35S*（每次加入100uCi可產(chǎn)生105-106cpm的抗體）。
c. 經(jīng)C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜，離心后，吸出培養(yǎng)上清，分別加入1/20體積的1mol/L Tris（PH8.0）及疊氮鈉至濃度0.02%。該標(biāo)記抗體可按純化單抗方法進(jìn)行。

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