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閱讀:298發布時間:2014-6-6
當用純化抗原進行選擇時,評價所選擇抗體的*方法是在高通量滴定模式下進行酶聯免疫吸附試驗(ELISA)。雖然這也許與抗體zui終使用無關,但它提供了一個起始的篩選實驗方案,能夠讓續后的分析集中在有希望的抗體上。大多數噬菌粒展示載體的設計容許進行兩種ELISA模式:
一種是噬菌體ELISA,即用標記的抗噬菌體二抗試劑檢測已結合的噬菌體;
另一種是可溶性scFv ELISA,即借助附在N端或C端上的表位標簽來檢測可溶性scFv。在這兩種情況下,抗體表達都由lacZ啟動子驅動。噬菌體展示取決于缺失葡萄糖時的滲漏表達,同時為了誘導可溶性抗體片段的表達,也需要使用IPTG。曾用來進行檢測的標簽包括:9E10、SV5以及FLAG。
總體上,盡管我們也發現一些抗體在噬菌體模式可以有信號,而在可溶性模式下卻消失,但兩種ELISA模式的結果是類似的。這也許是抗體發生了框移所致。當這些抗體展示在噬菌體表面時,會有大量的scFv被檢測到;而當表達為可溶性scFv時則不行。這種情況正如前面在肽文庫所描述的那樣。大多數目前所使用的噬菌粒載體都容許從噬菌體結合性scFv簡單切換到可溶性scFv。這要通過包括1個位于scFv基因和gⅢ之間的可抑制性琥珀密碼子(TAG)來實現。在一個非抑制株(如HB2151)中,琥珀密碼子被讀作為終止子,因此,只有可溶性scFv生成。在一個非抑制株(如TGi、DHSaF’)中,TAG密碼子讀作*以及終止密碼子,因此,可溶性scFv和scFv—pⅢ融合蛋白都將生成。也許理想的情況是,通過感染抑制株進行由噬菌體結合性scFv到可溶性scFv的轉換,但實際上這并不必要。可溶性scFv的表達在抑制株內是很容易完成的,因此,抑制通常不過50%。粗制噬菌體或scFv樣品就可適合于大多數的預分析試驗。然而,如能簡單地進行抗體純化對于后續分析是有利的。是用包含六*標簽的噬菌體載體,或者是將scFv基因亞克隆到一個將六*標簽融合到scFvC末端的載體中。
不同輪次選擇中,陽性克隆的比例將取決于抗體文庫質量、抗原性質和物理選擇過程,包括抗原密度、是否用可溶性或固相抗原以及洗滌嚴謹性。我們發現:按照免疫管選擇程序,在第二輪后一般有10%~*的克隆是陽性的。盡早評估多樣性,因為隨著選擇的進行,多樣性會降低。這樣就能提供一個更大容量的抗體文庫,便于從中選擇合適的抗體。
盡管結合性篩選方法是有用的,但這些常不將此法用于zui終的抗體選擇。能夠相對快速地生成大量抗體,可以容許建立一些除結合性方法之外的篩選方法。用于細胞內化、受體活化、配體拮抗、病毒滅活、誘導或抑制凋亡的各種選擇方法,均可預期。而且,在某些情況下,例如內化,甚或可能直接選擇具備這些功能的抗體。
采用ELISA時,噬菌體抗體可以在96孔微量滴定板中制備。將單個克隆挑人板孔中、培養并作為噬菌粒用輔助噬菌體進行救援。在微量板模式下噬菌體的生產效率不及更大體積的培養。這是因為不同克隆的生長率差異過大,結果有些克隆感染輔助噬菌體是在*OD值時,而其他克隆卻是在OD值過高或過低時感染。這就導致了不同孔中噬菌體滴度差異很大。
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