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閱讀:1366發布時間:2014-11-7
重組酶聚合酶擴增(Recombinase Polymerase Amplification,RPA),被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。以此為基礎的TwistAmp® 核酸擴增產品,能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。該技術對硬件設備的要求很低,特別適合用于體外診斷、獸醫、食品安全、生物安全、農業等領域。
在今年發表的一系列文章中,RPA技術被廣泛用于結核桿菌、耐藥菌MRSA、沙門氏菌等常見致病菌的檢測。在臨床診斷和食品安全方面,為人們提供了簡單快速的實地篩查方案。
RPA在臨床診斷領域的應用艱難梭狀芽孢桿菌(C. difficile)是一種會引起感染性腹瀉的重要致病菌。日前,研究人員以這種致病菌的毒力基因tcdB為靶標,開發了一個低成本的微流體RPA平臺,文章發表在十月二十三日的《Analyst》雜志上。這個檢測C. difficile的RPA分析芯片只需要6.4 µL的初始樣本,能夠對擴增反應進行實時監控。
據估計,世界上約三分之一的人體內潛伏著結核病(TB)的致病菌,這些致病菌大多在肺部處于休眠狀態。改善檢測方法幫助TB診斷,被WHO列為公共建康的首要問題之一。RPA作為一種常溫的快速DNA 擴增法,為資源匱乏的地區提供了檢測TB的簡便工具。研究人員在RPA的基礎上,快速檢測了結核分枝桿菌復合群MTC的DNA(IS6110 和IS1081)。在39°C的環境下,RPA檢測能在20分鐘內得出高靈敏度的結果。進一步研究表明,在檢測TB感染者的肺部樣本時,RPA檢測比熒光顯微鏡檢測還要準確。這項研究發表在今年八月份的《Plos one》雜志上。
抗生素濫用現象使耐藥菌日漸增多,目前這已經成為了一個性的公共健康問題。作為一種重要且危險的致病菌,耐**MRSA一直是臨床治療中的棘手問題。在對MRSA進行DNA檢測的時候,引物只能靶標一個多變的染色體區域,SCCmec。今年七月的《Plos one》雜志上發表的一項研究,通過多重RPA反應篩查了726個MRSA分離物。研究人員通過二代測序發現,24個RPA未檢出的分離物中出現了新的插入突變,需要重新設計擴增引物。這一結果說明,臨床上的MRSA篩查不能*依賴DNA檢測。(參考文獻:Recombinations in staphylococcal cassette chromosome mec elements compromise the molecular detection of methicillin resistance in Staphylococcus aureus.)
《Microchimica Acta》雜志今年二月的一項研究,展示了能夠同時擴增和檢測三種病原體的RPA芯片,包括淋病奈瑟氏菌(Neisseria gonorrhoeae)、沙門氏菌(Salmonella enterica)和MRSA。這種芯片可以在二十分鐘以內完成三種病原體和對照質粒的檢測,S. enterica和MRSA的檢出限可達10 CFU,N. gonorrhoeae的檢出限可達100 CFU。這項研究中的RPA芯片,有望成為實地篩查重要致病菌的簡便工具。(參考文獻Multiplex isothermal solid-phase recombinase polymerase amplification for the specific and fast DNA-based detection of three bacterial pathogens)(延伸閱讀:替代PCR,RPA在HIV檢測中大展身手)
RPA在食品安全領域的應用產志賀毒素的大腸埃希菌STEC是世界范圍內zui嚴重的一種食源性致病菌?!?/span>FOODBORNE PATHOGENS AND DISEASE》雜志今年七月發表的一項研究,在RPA的基礎上建立了等溫實時的STEC檢測體系。研究人員設計并評估了一系列引物和熒光探針,實現了很高的特異性和靈敏度。(參考文獻:Real-time isothermal detection of Shiga toxin-producing Escherichia coli using recombinase polymerase amplification.)
沙門氏菌是一種主要的食源性致病菌?!?/span>Analytical Chemistry》雜志今年三月份發表的一項研究,將TwistFlow®沙門氏檢測整合到微流體裝置中,構建了檢測沙門氏菌DNA的一體化分析系統。這一微流體裝置整合了致病菌檢測的三個主要步驟(DNA提取、RPA擴增和結果檢測),能夠在三十分鐘內以全自動的方式完成檢測。人們可以直接通過側流層析試紙條看到沙門氏菌檢測的結果。研究顯示,這種裝置。對PBS和牛奶的檢測下限分別為10 CFU/ml和100 CFU/ml。
PCR- ELISA已經是一個用途相當廣泛的成熟技術。《Analytica Chimica Acta》雜志今年二月發表的一項研究,用RPA取代了PCR,將快速的常溫擴增、*/鏈霉親和素體系、和比色法免疫分析結合起來。這種RPA-ELISA分析法可以用來篩查食品中的安全隱患,比如過敏原(榛子、花生、大豆、蕃茄和玉米)、轉基因成分(P35S和TNOS)、致病菌(Salmonella sp.和Cronobacter sp.)以及真菌(Fusarium sp.)。這項研究顯示,RPA-ELISA在上述應用中均得到了令人滿意的結果,有著很高的靈敏度和可重復性
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