一、測定意義：
活性氧（Reactive oxygen species, ROS）包括超氧自由基、過氧化氫、及其下游產物過氧化物和羥化物等，參與細胞生長增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過程。采用DCFH-DA(2，7-dichlorofuorescin diacetate)是迄今zui常用、zui靈敏的細胞內活性氧檢測探針。DCFH-DA 沒有熒光，進入細胞后被酯酶水解為 DCFH（dichlorofluorescin）。在活性氧存在時 DCFH被氧化為不能透過細胞膜的強綠色熒光物質 DCF（dichlorofluorescein）,其熒光在激發(fā)波長502nm，發(fā)射波長 530nm 附近有zui大波峰，強度與細胞內活性氧水平成正比。此活性氧檢測系統本底低，靈敏度高，重復性好，操作簡便。工作波長：*激發(fā)波長 500、485(500±15nm)，*發(fā)射波長 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC熒光檢測條件檢測。
二、試劑組成及保存：
1、0.1ml 10mM DCFH-DA in DMSO，−20℃保存。
2、1ml 活性氧供氫體，4℃保存
三、試劑準備（適用于細胞測定）：
1、DCFH-DA 可稀釋于培養(yǎng)基或緩沖液中。血清或培養(yǎng)基顏色并不影響 DCFH-DA 及細胞內熒光產生，但可能會影響熒光顯微鏡觀察，干擾熒光分光光度計、熒光酶標儀或流式細胞儀熒光測定。可將 DCFH-DA 稀釋于無酚紅培養(yǎng)基或適宜的緩沖液如 PBS 中。這依賴于使用何種熒光設備進行測定。
2、加入 DCFH-DA 的時機或孵育時間，以zui終能順利檢測細胞內活性氧為目的。藥物處理時間較短（﹤2 小時）或預計 ROS 效應較弱，可先加或同時加入 DCFH-DA。反之，藥物處理時間較長（﹥6 小時）或預計產生 ROS 效應較強，可后加 DCFH-DA。
3、活性氧供體含高純度 12mM H2O2。加入細胞后其本身即是一種活性氧，而且在代謝過程中可產生基它類型的活性氧，均可使 DCFH-DA 氧化為 DCF 呈現強綠色熒光。因而，用戶可使用該試劑作為測定實驗系統或儀器的陽性試劑，以初步觀察細胞活性氧所產生的熒光的一般特征。也可以將該試劑作為實驗的一個陽性對照，如流式細胞儀定量檢測活性氧，*該試劑的細胞工作濃度為 20～100µM 或更低濃度，但超過 200µM 將產生細胞毒。如果用戶熟悉 ROS 熒光或實驗沒有必要采用陽性對照，如熒光顯微鏡檢測可以不加該試劑。
四、操作步驟：
1、培養(yǎng)細胞的測定：（可用于流式細胞儀、熒光酶標儀、熒光分光度計測定或熒光顯微鏡觀察）加入熒光探針：
①、加入 DCFH-DA 于培養(yǎng)基，*初始工作濃度為 10µM。對不同的細胞和處理，DCFH-DA 工作濃度可為 100nM～20µM，需進行預實驗確定合適的濃度。總體稀釋倍數應在 1:500～1:1000以上以避免 DMSO 對細胞的影響。以 DMSO 作為溶劑對照；
②、37℃孵育細胞 30min～幾小時，通常為 30～60min 即可，孵育時間長短與細胞類型、刺激
條件、DCFH-DA 濃度有關；
③、細胞的收集：
懸浮細胞：1000g 離心 5～10 分鐘收集細胞，用 PBS 洗滌 1～2 次，離心收集細胞沉淀物用于熒光檢測；
貼壁細胞：用*消化細胞（* 0.25%的*消化 2～3 分鐘），加入培養(yǎng)基終止消化，制成細胞懸液，1000g 離心 5～10 分鐘收集細胞，用 PBS 洗滌 1～2 次，離心收集細胞沉淀物用于熒光檢測；
熒光檢測：
①、將收集好的細胞用 PBS 或無酚紅培養(yǎng)基重懸，并用于檢測；（*直接用 PBS 進行重懸）
②、波長設置：*激發(fā)波長 500、485(500±15nm)，*發(fā)射波長 525 (530±20 nm)。也可按照 FITC 熒光檢測條件檢測。
[注]：重懸的細胞密度因細胞的熒光強弱而定，如熒光較強可將細胞密度調小，如熒光較弱可將細胞密度調大，但所有樣本的細胞密度因保持一至。
2、組織樣本的測定：（可用于熒光酶標儀、熒光分光度計測定）
