RT┐PCR分析肉芽組織生長過程中VEGF及β3整合素

血管生成指在已有血管床基礎上長出新的毛細血管的過程，包括血管內皮細胞的激活，細胞外基質的降解，內皮細胞的增殖、移行，管腔結構形成及血管外膜的形成，然而迄今為止確切的機制尚不清楚.已有研究表明，許多病理過程如腫瘤的生長及轉移、糖尿病視網膜病變、類風濕性關節炎等，都與血管生成密切相關［1］ .生理狀態下，血管生成僅存在于胚胎發育、創傷愈合及女性生殖周期中，與病理性血管生成不同，這些過程中血管的生長受到嚴格調控，包括了增殖、成熟、退化三個階段，反映了血管生成的全過程.然而，對這些過程中血管生成的研究卻很少.生長因子和粘附分子作為血管生成的重要調節分子，越來越受到人們的重視，其中血管內皮生長因子（vas-cular endothelial growth factor，VEGF）和β3整合素是近年研究的熱點.本實驗旨在觀察肉芽組織生長過程中VEGF及β3整合素mRNA的表達，揭示它們與生理性血管生成的關系.
    
　　1 材料和方法
    
　　1.1 材料  肉芽組織標本均取自我院門診換藥室患者，4例為皮膚撕脫傷，1例為狗咬傷，患者年齡20～30歲，排除糖尿病等影響傷口愈合的疾患，分別于傷后7～12d和30～35d取創面組織.正常皮下組織取自我院手術患者.
    
　　1.2 試劑及儀器  異硫氰酸胍、Sarcosyl，AMV逆轉錄酶、Taq酶、dNTP，RNAsin分別購自原平生物公司和Promga公司;DNA THERMAL CYCLER480，美國PE公司;GDS凝膠成像系統，美國UVP公司.
   
　　1.3 RT┐PCR
    
　　1.3.1 引物設計  按文獻報道［2，3］，VEGF上游引物序列:5'-GCACCCATGGCAGAAGGAGGAG-3'，下游引物序列:5'-GTGCTGACGC-TAACTGACC-3'，PCR產物為567bp，495bp和363bp，β3整合素上游引物序列:5'-GTGCT-GACGCTAACTGACC-3'，下游引物序列:5'-CATGGTAGTGGAGGCAGAGT-3'，PCR產物為285bp.
    
　　1.3.2 總RNA提取及定量  所取組織用Chom-czynski改良一步法提取總RNA，通過測定A260 值計算RNA濃度，A260 /A280 判定純度.
    
　　1.3.3 RT-PCR反應  各組織總RNA均取1μg（10μL），加25μmol·L-1 逆轉錄引物（下游引物）1μL，70℃10min后立刻冰浴，加入下列成分:DW5μL，5x RT緩沖液5μL，10mmol·L-1 dNTP各1μL，RNasin0.5μL（25U），AMV1μL（5U），42℃逆轉錄1h，94℃5min，冰浴5min.各取RT產物10μL，進行PCR擴增，反應條件同于常規PCR，循環溫度為:94℃1min，55℃1min，72℃2min，循環數分別采用15，20，25和30，根據結果選擇合適循環數，避免PCR反應平臺期，zui終確定為25個循環，0.2g·L-1 瓊脂糖凝膠觀察結果.
    
　　1.3.4 熒光分析  瓊脂糖凝膠電泳結束后，在UVP凝膠成像系統上攝像，并用相應軟件通過對條帶大小及深淺的差別分別對不同組織RT-PCR擴增產物進行定量分析，結果采用*隨機化設計資料均數的t檢驗進行統計分析.
    
　　2 結果
    
　　VEGF有多種不同的mRNA拼接產物，本實驗選用引物可擴增出VEGF121 （363bp），VEGF165 （495bp）和VEGF189 （567bp）3種形式.電泳結果表明，VEGF可見3條擴增帶，大小同預期設計一致（Fig1）β3整合素PCR產物為265bp，電泳顯示300bp附近可見明顯擴增帶，與預期一致（Fig2）由電泳結果可以看出，正常皮下組織中VEGF及β3整合素mR-NA水平極低，在增殖期肉芽組織中表達明顯升高，在成熟期肉芽組織中表達又降低，而且，在VEGF的 3種不同拼接產物中，VEGF165 表達zui高.
   
　　圖像分析定量的結果表明，在增殖期肉芽組織中，VEGF及β3整合素mRNA水平高于成熟期肉芽組織（P<0.05）及正常皮下組織（P<0.01，Tab1）.
    
　　圖1 － 圖2 　略
    
　　3 討論
    
　　VEGF是近年發現的可以特異性作用于血管內皮細胞（EC）的生長因子.體外實驗證明VEGF可以直接促進EC的增殖，還可以通過提高已有血管的通透性，使血漿蛋白滲入基質，利于EC的移行，間接促進血管生成［4］ .β3整合素屬粘附分子家族成員，可與αIIb或αV亞基結合，其中αVβ3分子在血管生成中的作用備受關注，表達于細胞膜表面，識別細胞外基質的RGD序列，對于EC的移行有重要意義［5］ .本實驗表明，正常皮下組織中沒有血管生成的存在，VEGF及β3整合素mRNA的表達很低;在肉芽組織增殖期，HE切片證明EC在局部聚集成團，胞質增多，增殖明顯，增殖的EC借助與細胞外基質的結合移行形成大量新生血管芽，此時VEGF及β3整合素水平明顯增高，待肉芽組織*成熟后，新生血管逐漸成熟退化，二者的表達也隨之下降，表明VEGF及β3整合素可能是血管生成重要的始動分子，對于維持血管生成也有重要作用;同時也提示它們可以作為臨床血管生成治療的“靶分子”.VEGF及β3整合素受控表達的機制尚不清楚，缺氧及某些炎癥因子可能參與其中的調節［6，7］ .
    
　　表1 不同組織中VEGF及β3整合素mRNA表達水平的定量分析結果　略
          
　　RT-PCR適于用Northern blot檢測不到的低豐度RNA.實驗證明，同一循環體系下，模板量在一定濃度范圍內時，PCR產物條帶強度與模板量成比例關系;當循環次數處于PCR擴增的對數增長期時，PCR產物的熒光強度同模板量亦成比例關系［8］ ，因此用RT-PCR定量分析mRNA的關鍵是嚴格優化實驗條件，如模板量及循環次數的控制等，本實驗重復幾次結果一致.