近年來(lái)氨基酸分析在生物化學(xué)、藥學(xué)和臨床研究上都有著廣泛而重要的應(yīng)用.氨基酸的分離,尤其是氨基酸對(duì)映體的分離一直是國(guó)內(nèi)外的研究熱點(diǎn).在手性分離這一領(lǐng)域,液相色譜法（HPLC）一直是zui廣泛使用的方法.
　　
　　目前液相色譜分離手性化合物主要有兩種方法:一種是直接分離法,也就是利用手性固定相直接分離手性化合物對(duì)映體.王亞麗[1]等曾用纖維素-三（3,5-二甲基苯基氨基甲酸酯）（CDMPC）手性柱在正相模式下拆分了3種外消旋氨基酸的衍生物.另一種是間接分離法,目前主要是柱前衍生化法———將手性化合物柱前衍生化,將對(duì)映體轉(zhuǎn)化為非對(duì)映體,進(jìn)而使用常規(guī)柱完成分離分析.
　　
　　本文主要討論使用柱前衍生法分離多種氨基酸的對(duì)映體,并將化學(xué)計(jì)量學(xué)方法引入絲氨酸對(duì)映體重疊峰的分析,可以一次性地定量分析多種氨基酸對(duì)映體.所用衍生劑為鄰苯二甲醛（OPA）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）[2,3].NAC是一種手性硫醇,其它手性硫醇如N-乙酰-D-青霉胺（NAP）、N-異丁酰-L-半胱氨酸（IBLC）、N-異丁酰-D-半胱氨酸（IBDC）[4]也可與OPA一起做為衍生劑.
　　
　　1實(shí)驗(yàn)部分
　　
　　1.1試劑與儀器
　　
　　DL-絲氨酸（上海億欣生物科技有限公司）;L-絲氨酸、β丙氨酸、DL-丙氨酸、L-丙氨酸、DL-苯丙氨酸、L-苯丙氨酸、DL-纈氨酸、L-纈氨酸、硼酸、氯化鉀、氫氧化鈉、乙酸鈉（中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）;鄰苯二甲醛（以下簡(jiǎn)稱OPA,中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司）;N-乙酰-L-半胱氨酸（以下簡(jiǎn)稱NAC,Lancaster公司）;甲醇（HPLC級(jí),Merck公司）;高純水.除甲醇和水外其他試劑均為分析純.
　　
　　美國(guó)AglientHP1100液相色譜儀（DAD檢測(cè)器）,ChemStation化學(xué)工作站.
　　
　　美國(guó)Aglient8453UV-Vis光譜儀.
　　
　　1.2樣品預(yù)處理[5]
　　
　　各氨基酸樣品配制成濃度約為0.01M的水溶液.硼酸緩沖液的配制:硼酸（0.01M）、氫氧化鈉（0.01M）和水按體積比50∶45∶5配制得到pH為9.3的硼酸緩沖液.衍生劑的配制:將53.3mgOPA溶于50mL甲醇得到OPA甲醇溶液.NAC溶于硼酸緩沖液中（0.00286M）.取12mLOPA甲醇溶液、10mLNAC硼酸溶液,添加3mL硼酸緩沖液至25mL,得到OPAPNAC衍生劑.
　　
　　1.3衍生反應(yīng)
　　
　　將0.1mL氨基酸與5mLOPAPNAC衍生劑*混合5min后過(guò)濾進(jìn)樣分析.
　　
　　1.4色譜條件
　　
　　ZORBAXEclipseXDB-C8色譜柱（4.6mm3150mm,5μm）.
　　
　　不同比例的甲醇和0.05M醋酸鈉水溶液為流動(dòng)相,流速1mL·min-1,進(jìn)樣量20μL.
　　
　　所有的色譜分離均在室溫下進(jìn)行,在線檢測(cè)波長(zhǎng)為334nm,DAD檢測(cè)波長(zhǎng)范圍為190～400nm.
　　
　　非負(fù)矩陣因子分解（NMF）計(jì)算截取的數(shù)據(jù)波長(zhǎng)范圍為320nm～390nm.
　　
　　1.5數(shù)據(jù)處理方法
　　
　　本實(shí)驗(yàn)采用非負(fù)矩陣因子分解（NMF）[6]計(jì)算兩個(gè)混合組分的純譜.非負(fù)矩陣因子分解是在“非負(fù)”
　　
　　限制約束條件下的一種矩陣分解新方法,它的基本思路是將非負(fù)矩陣V分解成兩個(gè)非負(fù)因子矩陣W和H.NMF
　　
　　算法中采用了乘法更新公式（見(jiàn)公式（1）和（2））,所以不必采用其它限制條件即能保證分解結(jié)果“非負(fù)”.
　　
　　2結(jié)果與討論
　　
　　2.1氨基酸對(duì)映體的分離
　　
　　氨基酸與衍生劑的反應(yīng)生成異吲哚類產(chǎn)物[7],.由紫外測(cè)量得到的圖譜可看出,此類衍生產(chǎn)物在230nm和334nm處各有一個(gè)zui大吸收）.但由于230nm處較易受干擾,故在色譜實(shí)驗(yàn)中除了記錄全波長(zhǎng)數(shù)據(jù)外,選擇334nm作為檢測(cè)波長(zhǎng).
　　
　　下文中所提到的氨基酸色譜峰均為其經(jīng)過(guò)上述衍生化后所得到的衍生物的色譜峰.
　　
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在甲醇∶醋酸鈉溶液為30∶70的淋洗條件下,除DL-絲氨酸的兩種對(duì)映體有部分重疊外,DL-丙氨酸、DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸的對(duì)映體能得到基線分離,但是DL-纈氨酸的兩種對(duì)映體出峰時(shí)間為17min和25min,DL-苯丙氨酸的兩種對(duì)映體出峰時(shí)間為38min和43min.此分離條件下,不僅浪費(fèi)流動(dòng)相,而且峰形不理想.如果將流動(dòng)相的比例調(diào)節(jié)至45∶55，雖然可使DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸的對(duì)映體在10min內(nèi)洗脫出峰,但將使DL-絲氨酸及DL-丙氨酸*或部分重疊.
　　
　　考慮到DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸保留過(guò)強(qiáng)的情況,操作中采用了簡(jiǎn)單的梯度淋洗,在前三種氨基酸全部出峰后,改變流動(dòng)相配比使DL-纈氨酸和DL-苯丙氨酸快速出峰.淋洗方案如下:在0～6min內(nèi)保持甲醇∶醋酸鈉溶液為30∶70不變,在6～7min由此比例線性變化至45∶55,在7min以后保持45∶55不變.
　　
　　各對(duì)對(duì)映體的定性采用左旋光學(xué)純標(biāo)樣通過(guò)內(nèi)標(biāo)法確定.β丙氨酸沒(méi)有手性,沒(méi)有對(duì)映異構(gòu)體,只有一個(gè)色譜峰.
　　
　　2.2波譜解析法的使用
　　
　　盡管采用梯度洗脫,此譜中仍有一對(duì)重疊峰—絲氨酸的兩個(gè)對(duì)映體.在這種情況下,如果要定量分析此體系,知道兩組分的實(shí)際峰面積是必需的.我們使用非負(fù)矩陣因子分析解析出兩組分的純譜（見(jiàn)圖4）,但此結(jié)果與實(shí)際純譜還存在一個(gè)系數(shù)關(guān)系,即AXD-SerBXL-Ser=YDL-Ser.為得到兩組分實(shí)際的純譜,我們用zui小二乘回歸（leastsquaresregress,LSR）來(lái)計(jì)算系數(shù)A和B,得到的結(jié)果如下（見(jiàn)圖5）:A=72.59;B=75.98.此系數(shù)乘以各自組分的純譜即為兩組分的實(shí)際峰面積.
　　
　　2.3各對(duì)映體的定量分析
　　
　　2.3.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
　　
　　采用單一對(duì)映體標(biāo)樣在不同濃度值下的色譜峰面積或峰高建立標(biāo)準(zhǔn)曲線.
　　
　　實(shí)驗(yàn)中選用L-丙氨酸和L-苯丙氨酸作為兩種標(biāo)樣,L-丙氨酸對(duì)應(yīng)甲醇∶醋酸鈉=30∶70的色譜條件,L-苯丙氨酸對(duì)應(yīng)甲醇∶醋酸鈉=45∶55的色譜條件.以濃度對(duì)峰面積或峰高進(jìn)行線性擬和,得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程（見(jiàn)圖6,7）.通過(guò)此方程可以測(cè)定混合樣品中兩個(gè)標(biāo)樣組分的濃度.
　　
　　2.3.2其它組分相對(duì)濃度預(yù)報(bào)
　　
　　在同樣的色譜條件下,體系中各組分的含量比與其色譜峰面積比成線性關(guān)系.各組分的峰面積和所占面積面分比結(jié)果見(jiàn)表1,其中D-絲氨酸和L-絲氨酸的單峰面積是根據(jù)上述化學(xué)計(jì)量學(xué)方法計(jì)算而得.
　　
　　3結(jié)論
　　
　　本文運(yùn)用柱前衍生化法使用常規(guī)反相液相色譜實(shí)現(xiàn)了4種氨基酸對(duì)映體的拆分,達(dá)到了較好的分離效果,并實(shí)現(xiàn)了多組分定量分析.文中所用的淋洗方案也比較簡(jiǎn)單.使用計(jì)算方法解析重疊峰相對(duì)降低了對(duì)色譜峰分離度的要求,這對(duì)于分析更加復(fù)雜的樣品體系是很有幫助的。