技術(shù)背景

乙醛脫氫酶（aldehyde dehydrogenase；ALDH；EC1.2.1.3），又稱為乙醛NAD氧化還原酶（aldehyde NAD－oxidoreductase）是一類NAD（P）依賴性酶，催化廣譜的外源性或內(nèi)源性脂肪族和芳香族乙醛類底物氧化，包括乙醇、氨基酸、生物胺（biogenic amine）、維生素、固醇類、脂質(zhì)、藥物和環(huán)境分子等代謝產(chǎn)物。乙醛脫氫酶是乙醇在體內(nèi)分解代謝過程中兩種主要酶之一。乙醛脫氫酶把乙醛中的兩個(gè)氫原子脫掉，使乙醛轉(zhuǎn)化為乙酸，生成的乙酸進(jìn)入脂肪酸氧化途徑，最終被氧化成二氧化碳和水。乙醛脫氫酶主要有兩種同工酶：ALDH₁和ALDH₂。ALDH₁存在于胞液中，ALDH₂存在于線粒體中，ALDH₂比ALDH₁的活性高。乙醛脫氫酶的缺少，使酒精不能被*分解為水和二氧化碳，而是以乙醛繼續(xù)留在體內(nèi)，使人喝酒后產(chǎn)生欲吐、昏迷不適等醉酒癥狀。基于來自于乙醇代謝產(chǎn)生的乙醛（acetaldehyde），在7-羥基-3-（4-羥苯基）-異黃酮-7-糖苷（Daidzein-7-O-β-D-glucopyranoside；Daidzin）存在與否的情況下，由乙醛脫氫酶2的催化作用，轉(zhuǎn)化為乙酸（acetic acid）產(chǎn)物后，通過測(cè)定反應(yīng)體系中氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（oxidized reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NAD）轉(zhuǎn)化為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（reduced nicotinamide adenine dinucleotide；NADH）的變化（340nm 波長(zhǎng)），來定量分析乙醛脫氫酶2的特異活性。乙醛脫氫酶2反應(yīng)系統(tǒng)為：

產(chǎn)品內(nèi)容

GENMED清理液（Reagent A） 毫升

GENMED裂解液（Reagent B） 毫升

GENMED緩沖液（Reagent C） 毫升

GENMED反應(yīng)液（Reagent D） 毫升

GENMED底物液（Reagent E）   毫升

GENMED陰性液（Reagent F）   毫升

GENMED專性液（Reagent G）   微升

產(chǎn)品說明書    1份

保存方式

保存GENMED緩沖液（Reagent C）、GENMED反應(yīng)液（Reagent D）、GENMED底物液（Reagent E）和GENMED專性液（Reagent G）在－20℃冰箱里；其余的保存在4℃冰箱里；GENMED反應(yīng)液（Reagent D）和GENMED底物液（Reagent E）避免光照；有效保證6月

用戶自備

1.5毫升離心管：用于樣品保存的容器

15毫升錐形離心管：用于樣品制備的容器

細(xì)胞刮脫棒：用于脫離貼壁細(xì)胞

（微型）臺(tái)式離心機(jī)：用于樣品制備

比色皿或酶標(biāo)板：用于比色的容器

分光光度儀或酶標(biāo)儀：用于比色分析

實(shí)驗(yàn)步驟

一、 樣品準(zhǔn)備

1． 準(zhǔn)備好25cm²細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測(cè)培養(yǎng)細(xì)胞（1至5 X 10⁶細(xì)胞）

2． 小心加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），覆蓋生長(zhǎng)表面

3． 小心抽去清理液

4． 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞（注意：可以使用胰酶消化）

5． 加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞

6． 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管（注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始）

7． 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g

8． 小心抽去上清液

9． 加入xx微升GENMED裂解液（Reagent B），充分混勻

10． 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管

11． 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒

12． 置于冰槽里孵育30分鐘

13． 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

14． 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管

15． 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(cè)（注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

16． 即刻放進(jìn)－70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作

二、 測(cè)定準(zhǔn)備

1． 開啟并設(shè)定好分光光度儀（溫度為25℃）：波長(zhǎng)340nm，間隔60秒，讀數(shù)5次（共5分鐘），并置零 

2． 從－20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；GENMED底物液（Reagent E）避免光照；GENMED緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度

三、 背景對(duì)照測(cè)定

1． 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）

4． 在25℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent F）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為背景空對(duì)照（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)）

四、 樣品總活性測(cè)定

1。 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）

3． 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）

4． 在25℃溫度下孵育3分鐘

5． 加入20微升待測(cè)樣品（或50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

6． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

7． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

五、 樣品非特異活性測(cè)定 

1． 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿

2． 加入xx微升GENMED專性液（Reagent G）

3． 加入20微升待測(cè)樣品（或50微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

4． 上下傾倒數(shù)次，混勻

5． 在25℃溫度下孵育10分鐘

6． 加入xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）

7． 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）

8． 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）

9． 上下傾倒數(shù)次，混勻（限定在3秒之內(nèi)）

10． 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測(cè)，此為樣品讀數(shù)（5分鐘讀數(shù)－0分鐘讀數(shù)） 

六、計(jì)算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

2）樣品特異活性

七、 酶標(biāo)板測(cè)定

1. 背景對(duì)照和樣品總活性

1． 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：背景對(duì)照、樣品總活性

2． 分別移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3． 分別加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）

4． 分別加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）

5． 在25℃溫度下孵育3分鐘

6． 分別加入xx微升GENMED陰性液（Reagent F）或待測(cè)樣品（或10微克蛋白）到相應(yīng)孔中（注意：樣品須清澈）

7． 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

8． 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

2。 樣品非特異活性

1. 在96孔酶標(biāo)板上做好相應(yīng)標(biāo)記：樣品非特異活性

2. 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到96孔板中

3. 加入xx微升GENMED專性液（Reagent G）

4. 加入5微升待測(cè)樣品（或10微克蛋白）（注意：樣品須清澈）

5. 輕輕搖動(dòng)96孔酶標(biāo)板

6. 在25℃溫度下孵育10分鐘

7. 加入xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）

8. 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）

9. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）

10. 輕輕搖動(dòng)酶標(biāo)板

11. 即刻放進(jìn)酶標(biāo)儀檢測(cè)：0分鐘讀數(shù)和5分鐘讀數(shù)

3. 計(jì)算樣品活性

1）樣品活性（總活性或非特異活性）

2）樣品特異活性

注意事項(xiàng)

1． 本產(chǎn)品為20次（比色皿；10個(gè)樣本）和80次（酶標(biāo)板；40個(gè)樣本）操作，包括背景對(duì)照

2． 操作時(shí)，須戴手套

3． 用戶可以直接使用線粒體裂解懸液檢測(cè)更佳，減少干擾

4． 如果總蛋白檢測(cè)干擾過大，建議進(jìn)行樣本背景對(duì)照或采用線粒體樣本

5． 系統(tǒng)操作過程中，背景測(cè)定只需1次

6． 建議使用比色皿測(cè)定

7． 樣品須澄清，至關(guān)重要 

8． 加樣后3秒內(nèi)比色測(cè)定

9． 測(cè)定值由低到高變化；測(cè)定可持續(xù)5分鐘

10． 比色測(cè)定后，比色皿須清洗*

11． 樣本測(cè)定5分鐘讀數(shù)高于0分鐘讀數(shù)表明具有酶活性

12． 建議待測(cè)樣本蛋白濃度為50微克/20微升 （本公司提供 GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒－GMS30030.1）

13． 如果待測(cè)樣品濃度過高或過低，可以調(diào)整樣品濃度

14． 乙醛脫氫酶2單位活性定義為：在25℃，pH 8.0條件下，每分鐘內(nèi)能夠轉(zhuǎn)化1微摩爾氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）為還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）所需的酶量作為一個(gè)活性單位

15． 本公司提供系列乙醇代謝酶類檢測(cè)試劑產(chǎn)品

質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)

1． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定性能穩(wěn)定

2． 本產(chǎn)品經(jīng)鑒定檢測(cè)敏感