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細(xì)胞乙醛脫氫酶2活性比色法定量檢測試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟

2022年04月14日 14:49合肥萊爾生物科技有限公司點(diǎn)擊量：439

　　一、 樣品準(zhǔn)備
 
　　1. 準(zhǔn)備好25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶或60mm細(xì)胞培養(yǎng)皿的待測培養(yǎng)細(xì)胞(1至5 X 106細(xì)胞)
 
　　2. 小心加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），覆蓋生長表面
 
　　3. 小心抽去清理液
 
　　4. 使用細(xì)胞刮脫棒輕柔刮脫細(xì)胞(注意：可以使用胰l酶消化)
 
　　5. 加入xx毫升GENMED清理液（Reagent A），混勻細(xì)胞
 
　　6. 移入到預(yù)冷的15毫升錐形離心管(注意：懸浮細(xì)胞從這一步驟開始)
 
　　7. 放進(jìn)4℃臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為300g
 
　　8. 小心抽去上清液
 
　　9. 加入xx微升GENMED裂解液（Reagent B），充分混勻
 
　　10. 轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的1.5毫升離心管
 
　　11. 強(qiáng)力渦旋震蕩15秒
 
　　12. 置于冰槽里孵育30分鐘
 
　　13. 放進(jìn)4℃微型臺(tái)式離心機(jī)離心5分鐘，速度為16000g(或13000RPM，例如eppendorf 5415)
 
　　14. 小心移取500微升上清液到新的預(yù)冷的1.5毫升離心管
 
　　15. 移取10微升進(jìn)行蛋白定量檢測(注意：建議使用GENMED Bradford蛋白質(zhì)濃度定量試劑盒-GMS30030.1)
 
　　16. 即刻放進(jìn)-70℃保存或置于冰槽里繼續(xù)后續(xù)操作
 
　　二、 測定準(zhǔn)備
 
　　1. 開啟并設(shè)定好分光光度儀(溫度為25℃)：波長340nm，間隔60秒，讀數(shù)5次(共5分鐘)，并置零
 
　　2. 從-20℃冰箱里取出試劑，置于冰槽里融化；GENMED底物液（Reagent E）避免光照；GENMED緩沖液（Reagent C）置于室溫下均衡溫度
 
　　三、 背景對(duì)照測定
 
　　1. 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
 
　　2. 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）
 
　　3. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
 
　　4. 在25℃溫度下孵育3分鐘
 
　　5. 加入xx微升GENMED陰性液（Reagent F）
 
　　6. 上下傾倒數(shù)次，混勻(限定在3秒之內(nèi))
 
　　7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為背景空對(duì)照(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
 
　　四、 樣品總活性測定
 
　　1。 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
 
　　2. 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）
 
　　3. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
 
　　4. 在25℃溫度下孵育3分鐘
 
　　5. 加入20微升待測樣品(或50微克蛋白)(注意：樣品須清澈)
 
　　6. 上下傾倒數(shù)次，混勻(限定在3秒之內(nèi))
 
　　7. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
 
　　五、 樣品非特異活性測定
 
　　1. 移取xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）到新的比色皿
 
　　2. 加入xx微升GENMED專性液（ReagentG）
 
　　3. 加入20微升待測樣品(或50微克蛋白)(注意：樣品須清澈)
 
　　4. 上下傾倒數(shù)次，混勻
 
　　5. 在25℃溫度下孵育10分鐘
 
　　6. 加入xx微升GENMED緩沖液（Reagent C）
 
　　7. 加入xx微升GENMED反應(yīng)液（Reagent D）
 
　　8. 加入xx微升GENMED底物液（Reagent E）
 
　　9. 上下傾倒數(shù)次，混勻(限定在3秒之內(nèi))
 
　　10. 即刻放進(jìn)分光光度儀檢測，此為樣品讀數(shù)(5分鐘讀數(shù)-0分鐘讀數(shù))
 
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